بروتوكول لالحاده والمزمنة اختبار السمية الإيكولوجية Killifish الفيروز فورزيري نوثوبرانتشيوس

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة آثار المواد السامة على سمك الكيلي الفيروزي Nothobranchius furzeri. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم البيئية ، مثل الآثار طويلة المدى للضغوطات على سمات تاريخ الحياة المهمة ، أو وقت النضج أو النمو أو الخصوبة. الميزة الرئيسية لهذه التجربة هي أننا نستخدم فقاريات ذات دورة حياة سريعة جدا ، مما يؤدي إلى تجارب فعالة من حيث الوقت والتكلفة.

تعتبر أسماك الكيلي هذه نماذج مثالية لدراسة تأثير الآثار طويلة المدى ومتعددة الأجيال للضغوط. في النهاية ، سيساهمون في فهم أفضل للتأثير البيئي للمواد السامة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى جديدة حول التأثيرات المشتركة للمواد السامة ودرجة الحرارة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الضغوطات الأخرى مثل الأشعة فوق البنفسجية والحرمان من الطعام وتغيرات الأس الهيدروجيني.

من الصعب التعامل مع Killifish ، لأنها نظام نموذجي جديد في علم السموم البيئية ، ولأنها حساسة للعديد من الملوثات لا تزال غير معروفة. لقد طورنا فكرة هذه الطريقة التجريبية عندما علمنا لأول مرة عن العمر القصير الاستثنائي لسمك الكيليفيش ، وقدرتها على إنتاج بيض خامل يمكن تخزينه لسنوات على الرف. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن نوع التجربة ، وكذلك التعامل مع الأفراد ، يمكن أن يغير النتائج.

للبدء ، حدد حديقة gona ray ، أو بيض GRZ ، في مرحلة D3 ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال وجود عيون ذهبية. واستخدم زوجا ناعما من الملقط لنقلها برفق إلى خزان بلاستيكي سعة لترين. أضف سنتيمترا واحدا من وسط الفقس عند 12 درجة مئوية ، واترك درجة حرارة الماء تتكيف تدريجيا مع درجة حرارة الغرفة.

بعد 24 ساعة ، قم بإطعام الصغار جرعة مركزة من نوبلي الأرتيميا الطازجة ، وقم بزيادة عمق الماء إلى خمسة سنتيمترات عن طريق إضافة وسط السمك. بعد 48 ساعة من الفقس ، انقل اليرقات السليمة الطافية إلى حاويات فردية ذات وسط تعرض وتركيزات سامة كما هو موضح في بروتوكول النص. كل صباح ومساء ، افحص الأسماك بحثا عن الوفيات والإجهاد والمرض ، واحسب قيم LC50 وفقا لبروتوكول النص.

قم بإجراء تجربة التعرض المزمن عن طريق ملء الحاويات الفردية بوسط التعرض الصحيح ، وإضافة أنبوب هواء لتهوية البرطمان. انقل السمك إلى البرطمانات لبقية التجربة. من يومين إلى 23 يوما بعد الفقس أو DPH ، قم بإطعام السمك نوبلي الأرتيميا مرتين يوميا حسب الرضاية.

بعد ذلك ، بعد تناول مكملات يرقات chironomus المفرومة حتى 37 DPH ، استخدم يرقات chironomus المجمدة لإطعام الأسماك مرتين يوميا ، كل يوم ، للمضي قدما. لتحديد النمو ، قم بقياس حجم الجسم على أساس أسبوعي ، عن طريق نقل الأسماك إلى طبق بتري مملوء بالوسط من الخزان. التقط أربع إلى خمس صور عرض ظهرية معايرة الحجم للأسماك على ارتفاع ثابت.

واستخدم برنامج قياس مكاني لتحليلها رقميا. من 15 DPH فصاعدا ، افحص ذكور الأسماك بصريا بحثا عن التلوين ، لتحديد النضج. تحقق من الزعانف بحثا عن العلامات الأولى لتلوين الزواج ، واستخدم اليوم الذي كان فيه تلوين القبضة مرئيا كبديل لوقت نضج الذكور.

من 30 DPH فصاعدا ، تحقق من الخصوبة عن طريق إنشاء خزان تفريخ سعة لتر واحد للزوجين الناضجين من الذكور والإناث في كل علاج ، باستخدام وسط التعرض من حوض السمك للذكور ، واستكماله بركيزة التفريخ. انقل كل من الذكر والأنثى إلى خزان التفريخ. وأثناء تقليل النشاط البشري أو الاضطراب حول حاويات التفريخ ، اسمح لها بالتكاثر لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، دون خلط الماء غير الضروري ، والذي من شأنه أن يدور البيض في ركيزة التفريخ ، انقل الأسماك برفق إلى حاويات السكن الأصلية. قم بتصفية البيض عن طريق صب ركيزة التفريخ على شبكة 500 ميكرومتر. عد البيض واستخدم ماصة لنقله إلى طحالب الخث الرطبة في أطباق بتري.

قم بإزالة البيض الميت يوميا. بعد أسبوع ، استخدم فيلم مانع للتسرب لإغلاق طبق بتري. وقم بتخزينه في حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 28 درجة مئوية ، مع دورة من 14 إلى 10 من الضوء إلى الظلام ، للتطوير الفوري إلى المرحلة D3.

للحفظ على المدى الطويل ، قم بتخزين البيض في ظلام دائم عند 17 درجة مئوية ، حيث يدخل البيض في مرحلة السكون ، ويظل قابلا للحياة لعدة سنوات. لتجنيد الأسماك من البيض الخامل ، انقل البيض إلى 28 درجة مئوية ، ودورة من 14 إلى 10 من الضوء إلى الظلام ، لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا ، للسماح لها بالتطور إلى المرحلة D3. لقياس الحد الأقصى الحراري الحرج ، أو CT max للأسماك البالغة ، ابدأ بحمام مائي دائم الدوران ، يتم تسخينه بمعدل ثابت قدره 0.33 درجة مئوية في الدقيقة.

أضف عدة أكواد مائية سعة لتر واحد لكل سمكة على حدة. ابدأ المسار بإضافة الأسماك إلى الحوض ، عندما تصل المياه إلى درجة حرارة التربية التجريبية للأسماك. استخدم مقياس حرارة رقمي لمراقبة درجة الحرارة في الأحياء المائية سعة لتر واحد في حمام CT max ، كل خمس دقائق.

عندما تفشل السمكة في الحفاظ على وضع مستقيم بطني ظهري ، أو تبدأ في الوخز بشدة ، قم بقياس درجة الحرارة في حوض السمك سعة لتر واحد ، وهي درجة الحرارة القصوى الحرجة. ثم انقل الأسماك مرة أخرى إلى مسكنها التجريبي للاستعادة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، تسبب التعرض الحاد للإنفورزيري لتركيزات مختلفة من النحاس ، في زيادة الوفيات مع زيادة تركيز المواد السامة.

تنخفض قيم LC50 بمرور الوقت ، مما يعني أنه مع انخفاض التركيزات ، يمر المزيد من الوقت قبل أن يموت 50٪ من التكرارات. في فحص التعرض المزمن ، باستخدام النحاس المولود في الماء ، تكون الأسماك أقصر في الطول ، كما تم قياسها بعد ثلاثة أسابيع عند تربيتها بأعلى تركيز تم اختباره. في هذه التجربة باستخدام الكلوربيريفوس المنقولة بالماء أو CPH ، عند رفعها عند 28 درجة مئوية ، أنتجت الأسماك بيضا أقل عند تعرضها لأعلى تركيز CPF ، ومع ذلك ، عند 30 درجة مئوية ، أنتجت الأسماك الشاهدة بيضا أكثر من الأسماك المعرضة لأي من تركيزات CPF ، مما يشير إلى أن الجمع بين CPF وزيادة درجة الحرارة أثرت على الخصوبة أكثر من كل عامل ضغط على حدة.

تم الإبلاغ هنا عن متوسط العمر الذي ظهرت فيه أولى علامات التلوين في ذكور enfurzeri ، الذين تعرضوا ل CPF عند 28 و 30 درجة مئوية. بعد التعرض لأربعة ميكروغرامات لكل لتر من CPF ، استغرقت الأسماك الذكور 18٪ وقتا أطول لتنضج من الأسماك الشاهدة. كشف قياس الحد الأقصى للأشعة المقطعية للأسماك التي يتم تربيتها عند 24 أو 28 درجة مئوية ، والتعرض للملوث 3 ، 4-DCA أن السباحة غير المنتظمة ، وزيادة الحركة التشغيلية ، وفقدان القدرة على البقاء في وضع مستقيم ظهري بطني ، حدثت عند درجة حرارة منخفضة عندما تم تربية الأسماك عند 24 درجة مئوية.

بمجرد إتقانه ، يمكن قياس هذا البروتوكول ، بما في ذلك التأثيرات على الخصوبة ، في غضون شهرين. لقياس التأثيرات على فترة الإنجاب بأكملها أو حتى الجيل التالي ، يمكن تمديد البروتوكول ، ولكن لا يزال من الممكن إجراؤه في غضون ستة أشهر.