فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات
June 9th, 2018
كثيرا ما كانت التقليدية دراسات فقدان لوظيفة الجينات باستخدام الحيوانات خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. على أساس انهانسر كريسبر بوساطة الطفرات الجسدية أداة قوية لفهم وظائف الجينات في الجسم الحي. هنا، نحن التقرير طريقة لتحليل تعمل خروج المغلوب في تكاثر خلايا المخيخ.
الهدف العام من نهج نقل الجينات في الجسم الحي القائم على التثقيب الكهربائي هو تقييم أدوار الجينات ذات الأهمية في تمايز الخلايا الحبيبية المخيخية باستخدام تحليلات فقدان الوظيفة بوساطة كريسبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم الأعصاب التنموية والأورام العصبية ، مثل تحديد الجزيئات المهمة لنمو المخيخ الطبيعي وتكوينات أورام الدماغ. سيتم عرض إجراء التثقيب الكهربائي داخل الرحم من قبل الدكتورة لينا هيربست ، وهي طالبة ما بعد الدكتوراه من مختبر البروفيسور بيتر ليشتر ، وبعد ذلك سيتم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية التالية من قبل الدكتور ويجون فنغ ، وهو طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبر الدكتور هايكون دي.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي السعي إلى القضاء على الجينات ذات الأهمية في الخلايا المخيخية ، باستخدام تقنيات CRISPR-cas9 ، بدلا من توليد مزيج من بالضربة القاضية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة لوظائف الجينات أثناء التطور الطبيعي للمخيخ ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل تطور مناطق الدماغ المادية الأخرى ونمذجة أورام الدماغ. ابدأ بتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات في مجتذب ماصة دقيقة وسحبها لإنشاء طرف رفيع.
قم بتسمية الطرف الشعري بالحبر الأسود للحصول على تصور أفضل أثناء الحقن ، وارسم تحجيما على الزجاج. من خلال العمل تحت مجهر مجسم ، استخدم مسطرة وملاقط إبرة حادة لتقليم الطرف بطول حوالي ستة ملليمترات وإنشاء حافة مشطوفة حادة من جانب واحد. قم بتصفية محلول مخزون أخضر سريع بنسبة 1٪ من خلال مرشح نقطة الصفر ، 22 ميكرون لإزالة جزيئات الصبغة من المحلول.
امزج بلازميدات الحمض النووي الريبي أحادية التوجيه في أجزاء متساوية مع بلازميد مراسل لوسيفيراز إلى تركيز نهائي لا يقل عن ميكروغرام واحد لكل مليلتر لكل بلازميد. قم بتلوين محلول البلازميد باللون الأخضر السريع بتركيز نهائي قدره 0.5٪ بعد تخدير فأر CD-1 حامل بالأيزوفلوران ، ضع الفأر على ظهره على وسادة تسخين ، وقم بإعطاء المسكن. ضع مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء الجراحة.
إصلاح العدسة مع شريط وتعقيم البطن مع مطهر. قم بتغطية الماوس بالشاش ، مع ترك المنطقة الجراحية فقط مكشوفة. بعد إجراء شق جلدي يبلغ طوله حوالي سنتيمترين ، حدد موقع الخط ألبا واستخدم مقص مناديل غير حاد لعمل شق ثان أصغر قليلا عبر الصفاق.
بلل تجويف البطن المفتوح باستخدام PBS معقم مسخن مسبقا. بعد ذلك ، استخدم ملقط حلقي لاستخراج قرون الرحم بعناية من تجويف البطن. أمسك جدار الرحم عند الفجوة بين أكياس صفار البيض لجنينين متجاورين واسحبها برفق.
تجنب أي ضغط على الجنين أثناء سحبه عبر الشق. بمجرد استخراج قرون الرحم ، استنشق ما يقرب من 10 إلى 15 ميكرولترا من محلول البلازميد الملون باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المحضرة. تجنب أي فقاعات هواء أثناء هذه العملية.
أمسك الجنين برفق باستخدام ملقط حلقي وحدد موقع منطقة الرقبة. اخترق الدماغ الخلفي الظهري ببطء بطرف الشعيرات الدموية الزجاجية وانتقل إلى البطين الرابع. حقن حوالي ميكرولتر واحد من مزيج البلازميد.
تأكد من أن الحمض النووي المصبوغ لم يتسرب من الدماغ ، ويمكن رؤيته كهيكل على شكل ماسي. من المهم هنا ملء المنطقة بأكملها من البطين الرابع بمحلول البلازميد ، لتوصيل الحمض النووي أيضا إلى الجزء البعيد من المخيخ الأساسي. في الوقت نفسه ، تأكد من عدم التسبب في أي نزيف أثناء هذه العملية.
ضع ملاقط من البلاتين ، مزودة بألواح قطب كهربائي قطرها خمسة ملليمترات بشكل جانبي فوق رأس الجنين ، مع تغطية القطب السالب للأذن ، والقطب الموجب في المخيخ الأساسي فوق جدار الرحم ، وقم بتطبيق نبضات مربعة كهربائية. عندما يتم تكليف جميع الأجنة بالكهرباء ، ضع قرون الرحم بعناية مرة أخرى في تجويف البطن ، واملأها ب PBS المعقمة. دع قرون الرحم تنزلق إلى وضع طبيعي.
قم بإيقاف تشغيل التخدير وضع بطن لأسفل في قفص جديد للتعافي. قبل التشريح بالتبريد ، قم بإصلاح المخيخ طوال الليل في خمسة ملليلتر من 4٪ PFA في PBS لكل دماغ ، عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل المخيخ الثابت إلى عشرة ملليلتر من 30٪ سكروز في PBS لكل دماغ ، واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، بعد غرق الأنسجة في قاع الأنبوب ، قم بإزالة الدماغ من السكروز ، وامتصاص محلول السكروز المتبقي بقطعة من ورق ترشيح السليلوز. بعد ذلك ، اغمر كل مخيخ في مركب درجة حرارة القطع الأمثل في قالب بلاستيكي يمكن التخلص منه ، وقم بتجميده على الثلج الجاف. قم بتقطيع الكتلة المبردة إلى أقسام بسمك 10 ميكرون ، باستخدام ناظم التبريد ، واحتفظ بالأقسام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام.
عندما تكون جاهزا للمضي قدما في التلوين المناعي ، جفف الشرائح أولا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسلها مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة في PBS. ضع دائرة حول الأقسام بقلم مانع للسائل واحتضان الأقسام في محلول حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف الأجسام المضادة الأولية ضد الجزيئات ذات الأهمية في محلول الحجب ، واحتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.
اغسل الشرائح باستخدام 0.1٪ Triton التي تحتوي على PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. ثم أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور المخفف في محلول حجب يحتوي على DAPI ، واحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل الشرائح في PBS-T ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة ، ثم قم بتركيب الشرائح ، واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية حتى التصوير.
تم نقل خلايا hek293T التي تعبر بثبات عن المكورات العقدية المقيحة cas9 باستخدام sgRNA التي تعبر عن البلازميدات وتستهدفها. تمت مراقبة تعبير GFP في الخلايا الحية باستخدام جهاز تصوير الخلايا الفلورية بعد 48 ساعة من التعدي. تظهر هذه الصورة تسلسل sgRNA المتأثر بناء على تعبير GFP.
تظهر هذه الصورة عدم وجود تعبير GFP الناتج عن تسلسل sgRNA غير فعال. تظهر هذه الصور تلطيخا مناعيا ل GFP و Ki67 و p27 في المخيخ من فأر p7-rosa26-LSL-cas9 مع كاسيت توقف floxed وتسلسلات casistronic basistronic base9 و EGFP ، والتي كانت خاضعة للتثقيب الكهربائي عند E13.5 مع بلازميد Cre يعبر عن التحكم في sgRNA. القسم ملطخ ب DAPI.
لاحظ الخلايا التي تعبر عن GFP في طبقة الخلية الحبيبية الخارجية المميزة ب Ki67. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه الجراحة في أقل من 30 دقيقة لكل فأر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الجنين بعناية فائقة ، واستخدام الشعيرات الدموية ذات الرؤوس الحادة دائما ، ووضع الأقطاب الكهربائية في الزاوية الدقيقة لضمان توصيل النبضات الكهربائية إلى سقف البطين الرابع.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم الطبية لاستكشاف العوامل المسببة للاضطرابات العصبية ، بما في ذلك أورام المخ في مخيخ الفأر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تتناول هذه المقالة طريقة مستندة إلى الكهربائي لتعديل الجينات المتوسطة عن طريق الـ CRISPR لتحليل وظائف الجينات في الخلايا الحبيبية المخيخية. يسمح هذا النهج بتقييم فعال لأدوار الجينات في التطور الطبيعي للمخيخ وتكوين أورام الدماغ.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تحليل وظيفة الجينات
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- غالبًا ما تكون دراسات الحذف التقليدية مكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً.
- تُمكّن تقنية CRISPR من تحرير الجينات المستهدفة.
- المخيخ مهم للتحكم الحركي والوظائف المعرفية.
- فهم أدوار الجينات يمكن أن يضيء العمليات التنموية والمرضية.
غرض الدراسة
- لتقييم وظائف الجينات في تمايز الخلايا الحبيبية المخيخية.
- لتحديد الجزيئات المهمة لتطور المخيخ.
- لنمذجة تكوين أورام الدماغ باستخدام تقنيات حذف الجينات.
الطرق المستخدمة
- الكهربائي داخل الرحم لنقل الجينات.
- تقنية CRISPR-Cas9 لحذف الجينات.
- الكيمياء المناعية لتحليل التغيرات الخلوية.
- التعاون بين مختبرات بحثية متعددة.
النتائج الرئيسية
- أظهرت جدوى حذف الجينات في الخلايا المخيخية.
- قدمت رؤى حول وظائف الجينات أثناء تطور المخيخ.
- أظهرت تطبيقات محتملة في مناطق الدماغ الأخرى ونمذجة الأورام.
- سلطت الضوء على مزايا هذه الطريقة مقارنة بنماذج الحذف التقليدية.
الخلاصات
- توفر هذه الطريقة طريقة سريعة لدراسة وظائف الجينات في الجسم الحي.
- يمكنها أن تتقدم بشكل كبير في أبحاث علم الأعصاب التنموي.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى اضطرابات عصبية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
CRISPR-mediated somatic mutagenesis in cerebellar granule cells via in utero electroporation enables rapid, cost-effective functional interrogation of disease-relevant genes in neurodevelopmental and neuro-oncology research. This approach bypasses the time and resource constraints of germline models, supporting earlier target validation and mechanistic de-risking in the discovery pipeline. The method's quantitative phenotyping and chimeric modeling facilitate predictive confidence for portfolio triage and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct loss-of-function analysis of candidate genes implicated in brain malformations and tumors.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene function in disease-relevant neural cell populations.
- Facilitates rapid hypothesis testing without the need for full germline knockout model generation.
- Provides functional validation of genetic findings from patient-derived tissue sequencing.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chimeric brain tissue systems for downstream phenotypic screening and quantitative analysis.
- Delivers reproducible, GFP-labeled cell populations for standardized imaging and immunohistochemistry workflows.
- Enables scalable assessment of multiple sgRNA constructs for gene targeting efficiency.
- Supports robust comparison of gene knockout versus control conditions in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant somatic mutation modeling for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from genetic discovery to preclinical validation in neurodevelopmental and tumor contexts.
- Reduces late-stage biological risk by enabling early functional assessment of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, bridging genetic target identification with in vivo functional validation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for candidate neurodevelopmental genes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative phenotypic outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene knockout effects using immunohistochemistry and GFP-based readouts.
- Translational Research: Facilitates modeling of somatic mutations relevant to human brain disorders and tumors.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function interrogation across diverse neural targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurobiological pathways.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and supports scalable gene function studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental and neuro-oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero electroporation and CRISPR-Cas9 gene editing techniques.
- Demands access to specialized surgical, imaging, and molecular biology infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of plasmid design, delivery, and phenotypic analysis protocols.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require protocol optimization.
- Practical limitations include surgical skill requirements and potential variability in electroporation efficiency.
