فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

الهدف العام من نهج نقل الجينات في الجسم الحي القائم على التثقيب الكهربائي هو تقييم أدوار الجينات ذات الأهمية في تمايز الخلايا الحبيبية المخيخية باستخدام تحليلات فقدان الوظيفة بوساطة كريسبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم الأعصاب التنموية والأورام العصبية ، مثل تحديد الجزيئات المهمة لنمو المخيخ الطبيعي وتكوينات أورام الدماغ. سيتم عرض إجراء التثقيب الكهربائي داخل الرحم من قبل الدكتورة لينا هيربست ، وهي طالبة ما بعد الدكتوراه من مختبر البروفيسور بيتر ليشتر ، وبعد ذلك سيتم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية التالية من قبل الدكتور ويجون فنغ ، وهو طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبر الدكتور هايكون دي.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي السعي إلى القضاء على الجينات ذات الأهمية في الخلايا المخيخية ، باستخدام تقنيات CRISPR-cas9 ، بدلا من توليد مزيج من بالضربة القاضية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة لوظائف الجينات أثناء التطور الطبيعي للمخيخ ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل تطور مناطق الدماغ المادية الأخرى ونمذجة أورام الدماغ. ابدأ بتحميل الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات في مجتذب ماصة دقيقة وسحبها لإنشاء طرف رفيع.

قم بتسمية الطرف الشعري بالحبر الأسود للحصول على تصور أفضل أثناء الحقن ، وارسم تحجيما على الزجاج. من خلال العمل تحت مجهر مجسم ، استخدم مسطرة وملاقط إبرة حادة لتقليم الطرف بطول حوالي ستة ملليمترات وإنشاء حافة مشطوفة حادة من جانب واحد. قم بتصفية محلول مخزون أخضر سريع بنسبة 1٪ من خلال مرشح نقطة الصفر ، 22 ميكرون لإزالة جزيئات الصبغة من المحلول.

امزج بلازميدات الحمض النووي الريبي أحادية التوجيه في أجزاء متساوية مع بلازميد مراسل لوسيفيراز إلى تركيز نهائي لا يقل عن ميكروغرام واحد لكل مليلتر لكل بلازميد. قم بتلوين محلول البلازميد باللون الأخضر السريع بتركيز نهائي قدره 0.5٪ بعد تخدير فأر CD-1 حامل بالأيزوفلوران ، ضع الفأر على ظهره على وسادة تسخين ، وقم بإعطاء المسكن. ضع مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء الجراحة.

إصلاح العدسة مع شريط وتعقيم البطن مع مطهر. قم بتغطية الماوس بالشاش ، مع ترك المنطقة الجراحية فقط مكشوفة. بعد إجراء شق جلدي يبلغ طوله حوالي سنتيمترين ، حدد موقع الخط ألبا واستخدم مقص مناديل غير حاد لعمل شق ثان أصغر قليلا عبر الصفاق.

بلل تجويف البطن المفتوح باستخدام PBS معقم مسخن مسبقا. بعد ذلك ، استخدم ملقط حلقي لاستخراج قرون الرحم بعناية من تجويف البطن. أمسك جدار الرحم عند الفجوة بين أكياس صفار البيض لجنينين متجاورين واسحبها برفق.

تجنب أي ضغط على الجنين أثناء سحبه عبر الشق. بمجرد استخراج قرون الرحم ، استنشق ما يقرب من 10 إلى 15 ميكرولترا من محلول البلازميد الملون باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المحضرة. تجنب أي فقاعات هواء أثناء هذه العملية.

أمسك الجنين برفق باستخدام ملقط حلقي وحدد موقع منطقة الرقبة. اخترق الدماغ الخلفي الظهري ببطء بطرف الشعيرات الدموية الزجاجية وانتقل إلى البطين الرابع. حقن حوالي ميكرولتر واحد من مزيج البلازميد.

تأكد من أن الحمض النووي المصبوغ لم يتسرب من الدماغ ، ويمكن رؤيته كهيكل على شكل ماسي. من المهم هنا ملء المنطقة بأكملها من البطين الرابع بمحلول البلازميد ، لتوصيل الحمض النووي أيضا إلى الجزء البعيد من المخيخ الأساسي. في الوقت نفسه ، تأكد من عدم التسبب في أي نزيف أثناء هذه العملية.

ضع ملاقط من البلاتين ، مزودة بألواح قطب كهربائي قطرها خمسة ملليمترات بشكل جانبي فوق رأس الجنين ، مع تغطية القطب السالب للأذن ، والقطب الموجب في المخيخ الأساسي فوق جدار الرحم ، وقم بتطبيق نبضات مربعة كهربائية. عندما يتم تكليف جميع الأجنة بالكهرباء ، ضع قرون الرحم بعناية مرة أخرى في تجويف البطن ، واملأها ب PBS المعقمة. دع قرون الرحم تنزلق إلى وضع طبيعي.

قم بإيقاف تشغيل التخدير وضع بطن لأسفل في قفص جديد للتعافي. قبل التشريح بالتبريد ، قم بإصلاح المخيخ طوال الليل في خمسة ملليلتر من 4٪ PFA في PBS لكل دماغ ، عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل المخيخ الثابت إلى عشرة ملليلتر من 30٪ سكروز في PBS لكل دماغ ، واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، بعد غرق الأنسجة في قاع الأنبوب ، قم بإزالة الدماغ من السكروز ، وامتصاص محلول السكروز المتبقي بقطعة من ورق ترشيح السليلوز. بعد ذلك ، اغمر كل مخيخ في مركب درجة حرارة القطع الأمثل في قالب بلاستيكي يمكن التخلص منه ، وقم بتجميده على الثلج الجاف. قم بتقطيع الكتلة المبردة إلى أقسام بسمك 10 ميكرون ، باستخدام ناظم التبريد ، واحتفظ بالأقسام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام.

عندما تكون جاهزا للمضي قدما في التلوين المناعي ، جفف الشرائح أولا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسلها مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة في PBS. ضع دائرة حول الأقسام بقلم مانع للسائل واحتضان الأقسام في محلول حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف الأجسام المضادة الأولية ضد الجزيئات ذات الأهمية في محلول الحجب ، واحتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

اغسل الشرائح باستخدام 0.1٪ Triton التي تحتوي على PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. ثم أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور المخفف في محلول حجب يحتوي على DAPI ، واحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل الشرائح في PBS-T ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة ، ثم قم بتركيب الشرائح ، واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية حتى التصوير.

تم نقل خلايا hek293T التي تعبر بثبات عن المكورات العقدية المقيحة cas9 باستخدام sgRNA التي تعبر عن البلازميدات وتستهدفها. تمت مراقبة تعبير GFP في الخلايا الحية باستخدام جهاز تصوير الخلايا الفلورية بعد 48 ساعة من التعدي. تظهر هذه الصورة تسلسل sgRNA المتأثر بناء على تعبير GFP.

تظهر هذه الصورة عدم وجود تعبير GFP الناتج عن تسلسل sgRNA غير فعال. تظهر هذه الصور تلطيخا مناعيا ل GFP و Ki67 و p27 في المخيخ من فأر p7-rosa26-LSL-cas9 مع كاسيت توقف floxed وتسلسلات casistronic basistronic base9 و EGFP ، والتي كانت خاضعة للتثقيب الكهربائي عند E13.5 مع بلازميد Cre يعبر عن التحكم في sgRNA. القسم ملطخ ب DAPI.

لاحظ الخلايا التي تعبر عن GFP في طبقة الخلية الحبيبية الخارجية المميزة ب Ki67. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه الجراحة في أقل من 30 دقيقة لكل فأر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الجنين بعناية فائقة ، واستخدام الشعيرات الدموية ذات الرؤوس الحادة دائما ، ووضع الأقطاب الكهربائية في الزاوية الدقيقة لضمان توصيل النبضات الكهربائية إلى سقف البطين الرابع.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم الطبية لاستكشاف العوامل المسببة للاضطرابات العصبية ، بما في ذلك أورام المخ في مخيخ الفأر.