هلام-seq: طريقة لإعداد مكتبة تسلسل واحد من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي باستخدام مصفوفات المائية

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء مكتبات تسلسل من الجيل التالي من كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي لمجموعات صغيرة من الخلايا دون تقسيم العينة في أي وقت. توفر هذه الطريقة للباحثين نهجا جديدا لدراسة الاختلافات الهيكلية للحمض النووي في التعبير عن الجينات. عندما فكرنا لأول مرة في Gel-seq ، لم تكن هناك بروتوكولات لتسلسل كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي في وقت واحد من نفس العينة.

لحسن الحظ ، هناك الآن ثلاثة طرق منشورة تحل هذه المشكلة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على كل من المعلومات الجينومية والنسخية من نفس مجموعة الخلايا مقابل تكلفة إضافية ضئيلة. تم تطوير Gel-seq في الأصل باستخدام أشرطة منتصبة ، ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول للعمل مع أي كاسيت قياسي للرحلان الكهربائي الهلامي.

تحضير الحشو ، الكثافة العالية ، ومخاليط السليفة منخفضة الكثافة في ثلاثة أنابيب. أضف الكواشف بالترتيب الموصوف ، وقم بتدوير الخليط. لا تضيف قبل الأوان APS أو Temed.

انتظر حتى يتم توجيهك. بعد ذلك ، قم بإزالة كل محلول مونومر جل عن طريق إدخال إبرة أولا عبر الغطاء. ثم قم بتوصيل الإبرة بخط فراغ منزلي ، وغمر هذه المجموعة في حمام فوق صوتي.

انتظر حوالي دقيقة واحدة حتى لا تخرج المزيد من الفقاعات من السائل. بعد ذلك ، إلى خليط سلائف الحشو ، أضف Temed و APS و Vortex لفترة وجيزة. في غضون ثلاث دقائق ، استخدم ماصة بحجم ملليمتر واحد لإضافة ستة ملليمترات إلى كل علبة هلام دون انسكاب.

تأكد من أن السائل مستوي عن طريق وضع الكاسيت في وضع مستقيم على طاولة مستوية. بعد ذلك ، قم بتعبئة الكاسيت تدريجيا بالماء المتأين منزوع الغازات ، مع الحرص على تقليل خلط خليط البلمرة بالماء. ثم اترك البوليمر يجف لمدة ساعة إلى ليلة كاملة.

بمجرد معالجة البوليمر ، تخلص من تراكب الماء ، ومن على بعد ست بوصات استخدم تيارا لطيفا من الهواء المضغوط لتجفيف سطح الجل. بعد ذلك ، أضف Temed و APS إلى سلائف الجل عالية الكثافة ، والدوامة لفترة وجيزة. في غضون ثلاث دقائق ، انقل 320 ميكرولترا إلى كل كاسيت ، ووزعها على طبقة هلام الحشو عن طريق هز الكاسيت ذهابا وإيابا عدة مرات.

بعد ذلك ، قم بتعبئة الكاسيت بالماء منزوع الأيونات والغاز ، واترك البوليمر يجف لمدة ساعة تقريبا. بمجرد الشفاء ، جفف البوليمر كما كان من قبل. أخيرا ، أضف Temed و APS إلى خليط سلائف الجل منخفض الكثافة ، وقم بدوامه.

بعد ذلك ، املأ ما تبقى من الكاسيت بسرعة بهذا المزيج ، وأدخل أمشاط الجل قبل أن تبدأ في الشفاء. الآن ، أضف فائض السلائف الاحتياطية فوق المشط المراد امتصاصه أثناء البلمرة. بعد المعالجة ، يكون الكاسيت جاهزا للاستخدام.

بعد تحويل الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) ، استخدم مادة هلامية لاستعادة جزء الفائدة. أولا ، قم بتنظيف غرفة الرحلان الكهربائي تماما باستخدام عدة ملليلترات من منتج إزالة الحمض النووي ، ومسح خال من النسالة. بعد ذلك ، املأ الغرفة ب XTBE نظيفة ، صفر نقطة خمس ، وضع الجهاز بأكمله في فرن متشابك بالأشعة فوق البنفسجية سعة 254 نانومتر ، وقم بتعقيمه لمدة 15 دقيقة.

الآن ، أدخل كاسيت Gel-seq في غرفة الرحلان الكهربائي وأغلقه في مكانه. بعد ذلك ، قم بإزالة مشط الجل ببطء عن طريق السحب برفق لأعلى دون تمزيق الجل. الآن ، قم بتحميل العينات باستخدام ماصة.

أدخل الطرف بالكامل في الآبار عند تحميل العينات لتقليل فرصة التلوث بين الآبار. قم بتطبيق مجال كهربائي بمقدار 250 فولت عبر كاسيت Gel-seq لمدة 30 دقيقة لفصل gDNA عن الهجينة cDNA / RNA. بعد تحميل الجل وتشغيله وجمعه ، استخدم مشرطا لتقطيع الجل إلى نصفين أسفل الطبقة عالية الكثافة مباشرة ، وتخلص من نصف جل الحشو.

بعد ذلك ، قم بتقشير الجل المتبقي برفق من الكاسيت مع استخدام أداة الكشط بعناية. بعد التحقق من الفصل باستخدام مستند هلام ، استخدم transilluminator لاستئصال العصابات. يجب أن يكون gDNA موجودا في بداية الجل منخفض الكثافة ، ويجب أن يكون (كدنا) في واجهة المناطق منخفضة وعالية الكثافة.

الآن ، استخدم مشرطا لقطع مناطق الجل التي تحتوي على gDNA و cDNA. قم أيضا بإزالة نفس الأقسام من حارة التحكم السلبية. باستخدام ملاقط ضعيفة ، انقل أجزاء الجل برفق إلى أنابيب شريطية.

إذا انكسر الجل ، فابحث عن جميع القطع المكسورة وانقلها إلى الأنبوب. بعد ذلك ، قم بطحن كل هلام باستخدام حركات دائرية ، والضغط بطرف ماصة. قبل إزالة الأطراف ، أضف 40 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى gDNA ، و 80 ميكرولترا إلى عينات (كدنا

ثم قم بإزالة النصائح وتجاهلها بعناية. الآن ، قم بتأمين أنابيب الشريط في خلاط دوامة عند 37 درجة مئوية ورجها لمدة ثماني إلى 12 ساعة. وبالتالي سوف يراوغ الحمض النووي من الجل.

بعد الاهتزاز ، قم بتقطيع العينات إلى لوحة مرشح شبكية بحجم ثمانية ميكرون. ثم قم بتدوير الطبق بوزن 2 ، 600 جم لمدة خمس دقائق لتصفية شظايا الجل. بعد ذلك ، ارفع لوحة المرشح الشبكية بعيدا عن لوحة الإسكان واستخدم ماصة لنقل العينات الخالية من الهلام من اللوحة إلى أنابيب شريطية جديدة سعة 200 ميكرولتر.

إلى كل عينة تحتوي على gDNA ، أضف ميكرولتر واحد من البروتياز ، والماصة لأعلى ولأسفل لخلط جيدا. ثم احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يتبع ذلك بتنشيط التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

خطوة استنفاد النيوكليوسوم هذه أمر بالغ الأهمية. بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 18 لعمل ثقب في غطاء كل أنبوب عينة. بعد ذلك ، استخدم فراغ لتقليل عينات gDNA إلى خمسة ميكرولترات ، وعينات (كدنا) إلى 10 ميكرولترات.

إذا انخفض الحجم إلى ما دون الهدف ، أضف الماء الخالي من النوكلياز حسب الحاجة. تم فصل هجينة gDNA و cDNA / RNA فعليا باستخدام جهاز Gel-seq. لا يحتوي التحكم السلبي على مضان تلقائي للهلام في الواجهات.

تظهر سلالم الحمض النووي شريطا داكنا فقط عند الواجهة بين الأغشية منخفضة الكثافة وعالية الكثافة ، مما يكشف عن أن الشظايا الصغيرة يمكن أن تمر عبر الجل منخفض الكثافة. تظهر عينة بيولوجية من 500 خلية PC3 الفصل المطلوب للحمض النووي الجيني وهجينة cDNA / RNA. النطاق المظلم في الجزء العلوي من الغشاء منخفض الكثافة هو الحمض النووي الجيني على نطاق القاعدة الضخمة بينما يتم تكديس الهجينة cDNA / RNA في واجهة المناطق منخفضة وعالية الكثافة.

شظايا الزوج الأساسي الصغيرة دون 100 هي خارج المنتجات المستهدفة التي تم إنشاؤها من قليل النوكليوتيدات الأولية أثناء النسخ العكسي ومن المتوقع أن تكون متوقعة. تم إنشاء المكتبات من 500 خلية PC3 أو 750 خلية HeLa. تمت مقارنة توزيعات الأجزاء من المكتبات المتطابقة التي تم إنشاؤها من Gel-seq بالعينات غير المتطابقة التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكولات القياسية.

كان توزيع شظايا النيوكليوتيدات مشابها بأي من الطريقتين. تمت مقارنة نتائج تسلسل مكتبة خلايا PC3 بالطرق التقليدية. تمت مقارنة اختلافات عدد النسخ على مستوى الجينوم.

إحصائيا ، حصلت الطريقتان على نتائج مماثلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبات تسلسل من الجيل التالي مقترنة لكل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من نفس عينة البداية. كما هو الحال مع أي تجربة تسلسل منخفض المدخلات ، من الضروري أن تتذكر الحفاظ على بيئة عمل نظيفة.

يجب الانتباه جيدا إلى أنابيب التعقيم وقفازات التنظيف. حتى مع هذه الاحتياطات ، تفشل التجارب أحيانا بسبب التلوث. ملاحظة مهمة ، إن انتشار وسلامة المواد الهلامية بولي أكريلاميد تجعل من السهل نسيان أن سلائف التصنيع هي سموم عصبية خطيرة.

يجب عليك دائما العمل مع هذه الكواشف في غطاء الدخان وتنظيف أي انسكابات على الفور. لقد صممنا Gel-seq ليكون بسيطا للباحثين لتنفيذه في مختبراتهم الخاصة ، ونأمل أن يسهل ذلك التبني السريع لهذه التكنولوجيا.