تحديد خصائص الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام قياس التدفق الخلوي لعزل الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البشرية للتنميط الظاهري لمجموعات الخلايا المناعية المختلفة الموجودة داخل الأنسجة الدهنية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث التمثيل الغذائي ، مثل الخلايا المناعية التي تتراكم في الأنسجة الدهنية للأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة وإلى أي مدى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس المتزامن لعلامات متعددة على الخلايا المناعية وتحديد وقياس هذه الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية.

على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حاسمة لالتهاب الأنسجة الدهنية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأعضاء والأنسجة الأخرى. بشكل عام ، سيعاني الأفراد الجدد في هذه التقنية بشكل أساسي من تلوث الخلايا الوعائية اللحمية وفقدان الخلايا أثناء إجراء التلوين. سيقوم اثنان من مرشحي للدكتوراه ، سوزان ويتزلز وميتشل بيجنين ، بتنفيذ البروتوكول.

ابدأ باستخدام مشرط لفرم جرام واحد من خزعة الأنسجة الدهنية إلى قطع مربعة بحجم ملليمترين تقريبا. انقل القطع إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وأضف 10 مل من محلول الكولاجيناز إلى العينات. احتضان شظايا الأنسجة لمدة 60 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية بمعدل 60 دورة في الدقيقة.

يتبعه الترشيح من خلال مصفاة 200 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. شطف الفلتر بسبعة ملليلتر من PBS قبل الطرد المركزي. ثم استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية دون غمر طرف الماصة بالكامل في المحلول.

يجب أن تكون الحبيبات مرئية بوضوح وتزيل جميع المواد الطافية تقريبا لتجنب تلوث جزء الأوعية الدموية اللحمية بالخلايا الدهنية. نقوم بتعليق حبيبات الخلايا الوعائية اللحمية بخمسة ملليلتر من PBS الطازج ونقوم بتصفية جزء الأوعية الدموية اللحمية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب جديد. بعد الطرد المركزي ، نعلق حبيبات الكسر الوعائي اللحمي المغسولة في ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل كريات الدم الحمراء لمدة خمس دقائق على الجليد.

ثم إيقاف التحلل بسبعة ملليلتر من PBS وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. لتلطيخ جزء الأوعية الدموية اللحمية لتحليل التدفق الخلوي ، أعد تعليق الحبيبات في 90 ميكرولتر من فرز الخلايا المنشطة بأربع درجات مئوية ، أو عازلة FACS ، ومنع التلوين غير المحدد بعشرة ميكرولترات من IgG البشري. قسم معلق الخلية بين بئرين من صفيحة ذات قاع V مكون من 96 بئرا وضع الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، اغسل كل عينة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، مع قلب اللوحة رأسا على عقب بحركة واحدة سلسة دون النقر للتخلص من المواد الطافية في نهاية الطرد المركزي. تأكد من أنه يمكنك رؤية الحبيبات بوضوح في الجزء السفلي من اللوحة قبل قلبها رأسا على عقب لمنع فقدان خلاياك أثناء العملية. أعد تعليق الحبيبات الأولى في 29.5 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة FACS الأولى والحبيبات الثانية في 23 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة FACS الثانية.

بعد 30 دقيقة على الجليد في الظلام ، اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من عازلة FACS لكل بئر وقم بتثبيت كريات الخلية في 150 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة واحد بالمائة. انقل معلقات الخلية من كل بئر إلى أنابيب FACS المناسبة ووضع العينات على الجليد. قبل تحليلها ، قم بتحميل عنصر تحكم سلبي غير ملوث على مقياس التدفق الخلوي لتعيين معلمات التشتت الأمامي والتبعثر الجانبي.

ثم اضبط الفولتية لمقياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حتى تظهر جميع المجموعات السكانية المعنية في الرسوم البيانية المبعثرة الأمامية والمبعثرة الجانبية ، ويمكن التمييز بين الحطام والخلايا الحية. عندما يتم تعيين جميع المعلمات ، قم بتدوير العينة التجريبية الأولى عند 800 دورة في الدقيقة لإعادة تعليق الخلايا تماما وتحميل العينة على مقياس الخلويات. اقرأ ما لا يقل عن 50،000 حدث في البوابة الحية ، ثم قم بتدوير العينة الثانية وتحميلها للتحليل كما هو موضح للتو.

للسماح بتحليل مجموعات البلاعم في الأنسجة الدهنية في هذه التجربة التمثيلية ، تم استبعاد الخلايا المناعية الأخرى ، مثل الخلايا التائية والخلايا البائية والعدلات والخلايا القاتلة الطبيعية للكشف عن وجود CD11b + CD11c + البلاعم ، و CD11B + CD11C-macrophages ، و CD11Blow-CD11C + الخلايا المتغصنة. كشف القياس الكمي لشدة التألق الرئيسية لهذه الخلايا عن التعبير عن الخلايا المتغصنة الخلوية في البلازما وعلامات الخلايا المتغصنة العامة على خلايا CD11B + CD11C + و CD11Blow-CD11C + ، مع تعبير أعلى عن كلتا العلامتين لوحظت على خلايا CD11Blow-CD11C + ، مما يؤكد أن خلايا CD11Blow-CD11C + كانت في الواقع خلايا متغصنة. كشفت بوابات الخلايا الإيجابية CD45 عن مجموعات الخلايا التائية الإيجابية CD19 B و CD3 ، والتي يمكن تقسيم الأخيرة إلى مساعد CD3 + CD4 + T ، و CD3 + CD8 + مجموعات فرعية من الخلايا التائية السامة للخلايا ، و CD3-CD56 + الخلايا القاتلة الطبيعية.

ثم تم حساب النسبة المئوية للخلايا المناعية القابلة للحياة لكل موضوع ، مما يكشف عن زيادة كبيرة في النسبة المئوية للبلاعم CD11B + CD11C + البلاعم المؤيدة للالتهابات في الأنسجة الدهنية الحشوية للذكور البالغين الذين يعانون من السمنة المفرطة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على المخازن المؤقتة وكسور الخلايا على الجليد ، وأثناء تسمية الخلايا بالأجسام المضادة ، من المهم جدا إبقائها في الظلام.

بعد تطويرها ، سمحت هذه التقنية للباحثين في مجال أبحاث التمثيل الغذائي باستكشاف تغيرات الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية للبشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا المناعية للأنسجة الدهنية وكيفية إجراء قياس التدفق الخلوي على هذه الخلايا. ضع في اعتبارك أنك تعمل مع مواد ومواد بشرية يحتمل أن تكون معدية ، مثل الفورمالديهايد ، والتي يمكن أن تكون خطيرة.

اتخذ الاحتياطات دائما عند ارتداء القفازات ونظارات السلامة.