معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

الهدف العام من تفاعل الترسيب المناعي ELISA هذا هو تحديد ثابت التقارب لشريكي الارتباط بطريقة يمكن تكرارها وفعالة باستخدام خوارزمية جديدة. يمكن أن يساعد هذا الأسلوب في الإجابة على أسئلة رئيسية ليس فقط في مجال تفاعلات البروتينات والربيطات وأبحاث المستقبلات، ولكن أيضًا في العلوم الحياتية التطبيقية مثل البحوث الصيدلانية والفارماكولوجيا. تتمثل الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب في أنه يمكن تحديد ثابت تقارب تفاعل المستقبلات والربيطات بسهولة عن طريق ترسيب المستقبل بربيطة على لوحة ELISA وباستخدام خوارزمية تقييم جديدة.

ابدأ هذه العملية بتخفيف المحلول المخزون لمجال ألفا 2 ألفا من الإنتغرين إلى تركيز نهائي قدره خمسة ميكروجرامات لكل مليلتر في محلول TBS magnesite chloride buffer. سيتم استخدام كل من مجال ألفا 2 ألفا من الإنتغرين من النوع البري والمتحول في هذه العرض. املأ كل بئر من صف واحد على لوحة مايكروتيتر بمساحة نصف صف بـ 50 ميكرولتر من محلول طلاء مجال ألفا 2 ألفا من الإنتغرين.

قم بإجراء كل صف من التفاعلات بتكرار على الأقل مرتين. في هذا المثال، يتم إجراء كل صف من التفاعلات بتكرار أربع مرات. أغلق اللوحة بورق القصدير واتركها في درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي، أزل محلول الطلاء واملأ كل بئر بـ 15 ميكرولتر من محلول TBS magnesite chloride buffer. أزل محلول الغسل واملأ الآبار بمحلول غسل جديد. سيتم إزالة جزيئات المستقبل الذائبة التي لم يتم تثبيتها على السطح البلاستيكي عن طريق الامتصاص الفيزيائي.

الخطوة التالية هي منع المواقع غير المحددة من الارتباط بإضافة 50 ميكرولتر من محلول 1% BSA في محلول TBS magnesite chloride buffer إلى كل بئر. أغلق اللوحة مرة أخرى وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بينما يتم منع آبار لوحة مايكروتيتر من الارتباط بـ BSA، قم بإعداد تخفيف متسلسل للربيطة Rhodocetin.

يتم استخدام تركيز بداية قدره 243 ميكروجرام من Rhodocetin المكشوف بالسن وعامل تخفيف قدره 2.3 في هذه الحالة. لمنحنى التفاعل الثمانية في هذا التجربة، قم بإعداد 920 ميكرولتر من محلول Rhodocetin بالتركيز الأعلى في 1% BSA في TBS magnesite chloride في أنبوب الاختبار رقم واحد. قم بتوزيع 520 ميكرولتر من محلول 1% BSA في محلول TBS magnesite chloride في كل من أنبوب الاختبار العشرة الآخرين المرقمين من اثنين إلى أحد عشر.

قم بنقل 400 ميكرولتر من محلول Rhodocetin من أنبوب الاختبار إلى أنبوب الاختبار رقم اثنين. قم بمزج المحلولين عن طريق الاهتزاز ثم قم بنقل 400 ميكرولتر من هذا الخليط إلى أنبوب الاختبار رقم ثلاثة. استمر في هذا التخفيف المتسلسل حتى أنبوب الاختبار رقم أحد عشر.

من أجل نجاح هذه العملية، من المهم دائمًا ملء كل بئر بسرعة بالمحلول للتأكد من عدم جفاف الآبار. عند انتهاء فترة الحضانة لمدة ساعة، قم بإزالة محلول المنع من آبار لوحة مايكروتيتر. قم على الفور بإضافة 50 ميكرولتر من محلول Rhodocetin من أنبوب الاختبار رقم واحد إلى آبار العمود الأول، ومحلول أنبوب الاختبار رقم اثنين إلى آبار العمود الثاني، واستمر حتى العمود الحادي عشر.

أضف 50 ميكرولتر من 1% BSA وTBS magnesite chloride كتحكم خالي من الربيب إلى آبار العمود الثاني عشر. أغلق اللوحة مرة أخرى وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف. لإزالة جزيئات الربيب غير المرتبطة، قم بإزالة محلول الارتباط واملأ كل بئر بـ 50 ميكرولتر من محلول HBS magnesite chloride buffer.

ثم قم بإزالة محلول HBS وإضافة محلول HBS جديد. لتثبيت المستقبل وجزيئات الربيب المرتبطة كيميائيًا، قم بملء كل بئر من لوحة مايكروتيتر بـ 50 ميكرولتر من محلول 2.5% glutaraldehyde في محلول HBS magnesite chloride buffer. حضن لوحة مايكروتيتر في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.

أزل محلول التثبيت وقم بإيقاف تفاعل glutaraldehyde الزائد عن طريق إزالة محلول التثبيت وملء كل بئر بـ 50 ميكرولتر من محلول TBS magnesite chloride buffer. أزل محلول الغسل وأضف محلول غسل جديد إلى كل بئر. لبدء هذا الفحص، قم بإزالة محلول الغسل من كل آبار لوحة مايكروتيتر وأضف إلى كل بئر 50 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأولي، المخفف من واحد إلى ألفين في 1% BSA TBS magnesite chloride.

أغلق اللوحة مرة أخرى وحضنها في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأولي من كل الآبار وأضف إلى كل بئر 50 ميكرولتر من محلول TBS magnesite chloride buffer. قم بالغسل ثلاث مرات بمحلول TBS magnesite chloride buffer.

بعد ذلك، أضف إلى كل بئر 50 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي، المخفف من واحد إلى ألفين في 1% BSA في TBS magnesite chloride. أغلق اللوحة مرة أخرى واتركها في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الجسم المضاد الثانوي من الآبار وأضف إلى كل بئر 50 ميكرولتر من محلول TBS magnesite chloride buffer.

قم بالغسل ثلاث مرات. بعد الغسل الثالث، قم بضرب لوحة مايكروتيتر على قطعة قماش لإزالة جميع آثار السائل. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإضافة 50 ميكرولتر من محلول كشف الفسفاتاز القلوي إلى كل بئر من لوحة مايكروتيتر على الفور لبدء التحويل الأنزيمي بشكل متزامن قدر الإمكان.

حضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة حتى تتحول المحلول في الآبار ذات التركيز الأعلى للربيط إلى اللون الأصفر. اعتمادًا على كثافة الإشارة، قد يتراوح وقت الحضانة بين خمس دقائق وساعة واحدة. قم بإيقاف تحويل ركيزة الفسفاتاز باستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم 1.5 مولار إلى كل بئر بنفس ترتيب إضافة محلول كشف الفسفاتاز القلوي.

اترك اللوحة لعدة دقائق لضمان خلط خالٍ من الخطوط لكلا المحلولين. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 405 نانومتر لكل بئر باستخدام قارئ ELISA. ابدأ تحليل البيانات بفتح جدول البيانات الأولية.

انسخ الأعمدة من ملف Excel، وافتح Graph Pad Prism Five، وافتح ملف مشروع جديد في القائمة الرئيسية ومن تحت بيانات وجرافيك جديد، اختر تنسيق X Y. اختر خيار إدخال ورسم نقطة مفردة لكل قيمة على محور Y والصقها في جدول البيانات في Graph Pad Prism كقيم X و y على التوالي. قم بتحويل الكثافة الضوئية عند 405 نانومتر إلى تنسيق الأعمدة.

في جدول البيانات، يمثل العمود الأول التركيزات كربيطة مضافة كقيم X، بينما تحتوي الأعمدة الموجودة على اليمين على قيم الإشارة لمنحنى التفاعل الثمانية كقيم Y. حيث سيتم رسم رسم نصف لوغاريتم، يتم حذف الصف الأخير الذي يحسب إشارات الربيطات الخالية من الربيب، التركيز صفر. يقوم Graph Pad Prism برسم المخطط الذي يظهر في قسم الرسم البياني.

بالنسبة لمحور X، يتم اختيار مقياس نصف لوغاريتم. يعرض محور X قيم الإشارة المقاسة كقيم OD عند 405 نانومتر. عن طريق النقر المزدوج على أي من الرموز، يمكن تحديدها وتمييزها بأشكال وألوان بسيطة.

تم تمييز قيم التفاعل للشكل من النوع البري بدوائر ذات تظليل أحمر مختلف، بينما تم تمييز إشارات التفاعل للشكل المتحول بمربعات زرقاء. افتح البرنامج الفرعي للتحليل وتحت تحليل X Y، اختر خيار الانحدار غير الخطي واضغط