منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير العمليات الديناميكية طوليا في الديدان الخيطية البالغة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة لتتبع الاستجابات السلوكية للديدان وحركية التعبير الجيني للدودة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تكيف مع التغيرات في بيئتها ، بما في ذلك الاختلافات في السلوكيات الأساسية والتعبير الجيني والذاكرة والتعلم. تسمح هذه التقنية بالملاحظة الطولية المتعددة للحيوانات الفردية في ظل بيئات يتم التحكم فيها ديناميكيا ، بالإضافة إلى أخذ العينات المتزامنة لجوانب متعددة من التكيف بدقة عالية.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى الفهم الكمي للتكيف الحيواني ، حيث يمكن أن يسهل الحصول على بيانات حركية عالية الدقة النمذجة الرياضية وصياغة واختبار الفرضيات المعقدة. لإعداد الجهاز لهذا الإجراء ، قم أولا بتوصيل طرف حقنة المخرج بقطعة 50 سم من أنبوب الحقنة. لعمل إبرة محول ، استخدم كماشة لسحب عمود الإبرة من محور الإبرة بمقياس 20 × إبرة نصف بوصة واستخدم موقد بنسن لإزالة البقايا البلاستيكية المتبقية.

أمسك طرفي الإبرة بكماشة ، وثني إبرة المحول وفقا لهندسة الإعداد التجريبي وقم بتوصيل الإبرة في منتصف الطريق في الطرف الآخر من أنبوب حقنة المخرج. بعد ذلك ، قم بتوصيل طرف حقنة مدخل عازلة واحد مباشرة بصمام ثلاثي الاتجاهات وقم بتوصيل حقنة مدخل عازلة بقطعة متر واحد من أنبوب الحقنة. أدخل إبرة المحول في منتصف الطريق في الطرف المفتوح للأنبوب ، قم بتوصيل حقنة التبادل العازلة بقطعة 50 سم من أنبوب الحقنة عبر طرف المحقنة.

قم بتوصيل أنبوب المحقنة بالمنفذ المتبقي للصمام ثلاثي الاتجاهات وأغلق الصمام. باستخدام إبرة محول ، قم بتوصيل حقنة مدخل الدودة بقطعة متر واحد من أنبوب الحقنة كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، اشطف جميع المواد مرتين باستخدام S-medium واملأ المحاقن والأنابيب المغسولة بوسط S جديد ، مع الحرص على إزالة أي فقاعات هواء.

الآن ، قم بتوصيل أنبوب حقنة المخرج بمخرج الجهاز وقم بتوصيل إبرة المحول في نهاية أنبوب حقنة المخرج بمنفذ المخرج. قم بحقن كمية صغيرة من S-medium من خلال المخرج لملء الجهاز حتى يخرج S-medium من كل من المخزن المؤقت ومداخل الدودة. قم بتوصيل أنبوب حقنة مدخل المخزن المؤقت بمنفذ مدخل المخزن المؤقت للجهاز وقم بتوصيل مدخل الدودة بدبوس وتد من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر ثلاثين ثانية من البوصة.

قم بتركيب جهاز الموائع الدقيقة على مجهر مضان مقلوب بمرحلة آلية وقم بلصق مضخة حقنة على شاكر بالقرب من المجهر حتى لا تهتز المضخة أثناء الاهتزاز. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة مدخل المخزن المؤقت على مضخة الحقنة واضبط المضخة لتوصيل تدفق مستمر من S-medium إلى الجهاز بمعدل تدفق ثلاثة ميكرولتر في الدقيقة. لتحميل البكتيريا في جهاز الموائع الدقيقة ، قم أولا بتحميل حقنة جديدة بتعليق عالي الكثافة من الإشريكية القولونية OP50.

اقلب المحقنة عموديا ، واضغط على البرميل عدة مرات لتجميع كل فقاعات الهواء في الجزء العلوي من المحقنة. قم بإيقاف تشغيل شاكر المداري وأغلق الصمام ثلاثي الاتجاهات لمحاقن مدخل العازلة. استبدل حقنة مدخل العازلة بالمحقنة المحملة بالبكتيريا وادفع كل الهواء المتجمع في الجزء العلوي من المحقنة حتى يدخل القليل من التعليق البكتيري إلى نظام التبادل العازل ولا تبقى فقاعات في المحقنة المحملة ب OP50 أو الصمام.

مع إغلاق الصمام، قم بتوصيل المحقنة المحملة بالبكتيريا بمضخة الحقنة وقم بتشغيل شاكر المدار. اضبط سرعة الاهتزاز على حوالي 200 دورة في الدقيقة ومعدل التدفق على 100 ميكرولتر في الدقيقة. بمجرد انتشار المخزن المؤقت OP50 في جميع أنحاء الجهاز ، اضبط معدل التدفق مرة أخرى على ثلاثة ميكرولتر في الدقيقة.

لتحميل الجهاز بالديدان الخيطية ، املأ أولا أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط سعة 650 ميكرولتر ب 100 ميكرولتر من تعليق OP50 الطازج ، واستخدم معول دودة لنقل 20 إلى 30 ديدة شابة متزامنة مع العمر بشكل فردي من صفيحة أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية إلى الأنبوب. املأ حقنة مدخل الدودة وأنبوب الحقنة بتعليق OP50 جديد وحقن ما يقرب من 500 ميكرولتر من التعليق في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، اسحب معلق الدودة في أنبوب حقنة مدخل الدودة وقم بتوصيل حقنة مدخل الدودة بمدخل الدودة.

حقن جميع الديدان من خلال أنبوب حقنة مدخل الدودة في جهاز الموائع الدقيقة وافصل حقنة مدخل الدودة وأنبوب المحقنة. قم بتوصيل مدخل الدودة بدبوس وافصل حقنة مدخل العازلة عن المضخة الميكانيكية. استخدم حقنة مدخل المخزن المؤقت لنقل الديدان يدويا إلى القنوات ، وحقنة المخرج لعكس حركة الدودة حسب الضرورة.

يتطلب تحميل بعض التنسيق. استخدم دفعات لطيفة على غطاسات الحقنة لمحاذاة القناة ودفعة أقوى إلى حد ما لدفع الدودة على طول الطريق. بعد ذلك ، دع الديدان تتكيف مع بيئتها الجديدة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات قبل بدء التجربة.

تقتصر الديدان على قنواتها ، لكنها ليست مشمولة. ستبقى معظم الديدان في قنواتها طوال مدة التجربة ، لكن بعضها قد يهرب أو يتشابك في الشقوق الدقيقة. هنا ، يمكن ملاحظة صور المجال الساطع لدودة تمثيلية واحدة على مدار عشر ساعات في الجهاز.

باستخدام الديدان المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP تحت جين الاستجابة المناعية المحفز الأول ، عند P.Aeruginosa ، عدوى PA14 ، لوحظ تعبير GFP في منتصف الجسم وذيل الدودة خلال الساعات الخمس الأولى من التعرض لمسببات الأمراض ، ويزداد إلى تعبير قوي لكامل الجسم خلال الساعات الخمس المقبلة. يوضح رسم التألق الكلي لكل دودة كدالة للوقت بعد الإصابة ديناميكيات جين الاستجابة المناعية ، الحث الأول ، بالإضافة إلى تباين الدودة إلى الدودة في توقيت ومدى الحث. يسمح التصوير بفاصل زمني للبيض الذي تضعه الديدان في كل قناة برسم العدد التراكمي للبيض الذي تضعه كل دودة كدالة للوقت بعد الإصابة ويلتقط إلى بالإضافة إلى الانخفاض الناجم عن مسببات الأمراض في وضع البيض مع تقدم العدوى.

بمجرد إتقانه ، يمكن تحضير جهاز الموائع الدقيقة وتحميله في ساعة واحدة. بمجرد تحميل الجهاز وتأقلم الديدان ، يمكن توصيل الكواشف الأخرى مثل أدوية معينة أو إشارات كيميائية ذات أهمية إلى الديدان للإجابة على أسئلة إضافية حول التحكم في الديدان الخيطية والخلايا العصبية والجينية. بعد تطويرها ، استخدمنا نحن والمتعاونون معنا هذه التقنية لتشريح سلوكيات تغذية الديدان الخيطية بالإضافة إلى الاستجابات الوراثية للديدان لعدوى الصدمة الحرارية والمجاعة في مجموعة متنوعة من البيئات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام جهاز الموائع الدقيقة لأداء المقالات الطولية.