التحديد الكمي لوفرة الدهن وتقييم توزيع الدهن في ايليجانس كاينورهابديتيس "الأحمر النيل" و "النفط تلطيخ س الأحمر"

الهدف العام من طرق التلوين هذه هو تحديد وفرة الدهون داخل الخلايا وتقييم توزيع الدهون بين الأنسجة المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في استقلاب الدهون مثل كيفية تنظيم الدهون وراثيا وكيميائيا حيويا والحالات المرضية التي تنظم توازن الدهون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وغير مكلفة للتنفيذ.

لإجراء تلطيخ الدهون النيلي الأحمر ، يتم زرع الديدان الصفيحية على وسط نمو الديدان الخيطية أو NGM مع السجل المتأخر OP50 الإشريكية القولونية وتنمو الديدان عند 20 درجة مئوية إلى المرحلة المبكرة L4. اغسل الديدان بملليمتر واحد من محلول PBST وانقل تعليق الدودة إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي للديدان بقوة 560 ضعف الجاذبية لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم بإزالة المادة الطافية وكرر غسل PBST حتى يتم إزالة الإشريكية القولونية من التعليق. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 40٪ أيزوبروبانول أو 60٪ لتلوين ORO واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. تعد إضافة الأيزوبروبانول أمرا بالغ الأهمية للنفاذية المناسبة للديدان قبل تلطيخها.

قم بالطرد المركزي للديدان عند 560 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة وإزالة المادة الطافية دون تعطيل الحبيبات الدودية. من المهم تقليل التعرض للضوء أثناء خطوات الطرد المركزي. الآن أثناء وجودك في الظلام ، أضف 600 ميكرولتر من محلول عمل NR المعد مسبقا لكل عينة.

اقلب الأنابيب ثلاث مرات واخلط الديدان والمحلول بالكامل. ثم احتضان العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للديدان وإزالة المادة الطافية.

ثم أضف 600 ميكرولتر من PBST واحتضان العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة لإزالة بقعة NR الزائدة. بعد تدوير العينات مرة أخرى كما كان من قبل ، قم بإزالة جميع المواد الطافية باستثناء حوالي 50 ميكرولترا وأعد تعليق حبيبات الدودة في المحلول المتبقي. لتحضير الشرائح للتصوير ، ضع الماصة خمسة ميكرولترات من تعليق الدودة على شريحة مجهرية وقم بتطبيق غطاء بعناية لتجنب محاصرة أي فقاعات هواء.

باستخدام قناة FITC GFP لتصوير الديدان الملطخة ب NR وتجربة أوقات تعرض مختلفة ، قم بتصوير الديدان بتكبير خمسة أضعاف لالتقاط العديد من في كل مجال رؤية. ثم قم بالتبديل إلى التكبير بمقدار 10 أضعاف للحصول على تقدير أفضل للديدان الفردية. لتحديد الصور كميا ، قم بتحميل الصور المجهرية إلى ImageJ.

في القائمة المنسدلة للصورة، اضبط السطوع وتباين مجموعة الصور وقم بنشر التغييرات على جميع الصور بالنقر فوق تطبيق. استخدم أداة تحديد المضلع لتحديد كل دودة مصورة وتحت القائمة المنسدلة للتحليل ، استخدم وظيفة القياس لتأهيل شدة التألق المنبعثة من NR. لكل صورة ، قم بقياس خمسة مواقع للخلفية واحسب متوسط شدة مضان الخلفية. أضف 600 ميكرولتر من محلول عمل Oil Red O أو ORO إلى كل عينة واقلب الأنبوب ثلاث مرات لخلط الديدان جيدا و ORO.

قم بتدوير العينات عند 30 دورة في الدقيقة و RT لمدة ساعتين. الطرد المركزي للعينات عند 560 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة وشفط كل المادة الطافية باستثناء 100 ميكرولتر. ثم استخدم 600 ميكرولتر من PBST لإعادة تعليق العينات وتدوير الأنابيب عند 30 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة لإزالة تلطيخ ORO الزائد.

لتمييز موقع الخط الجرثومي للحيوانات في الخلايا المعوية بشكل أفضل ، قم بتلطيخ النوى عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من DAPI لكل مليلتر واحد من محلول عمل ORO. ثم لإعداد شرائح للتصوير ، قم بإعادة تعليق الديدان والمادة الطافية المتبقية واخلط المحلول جيدا. ضع خمسة ميكرولترات من تعليق الدودة على شريحة مجهرية وقم بتطبيق غطاء بعناية لضمان عدم تشكل فقاعات هواء.

لتصوير الديدان الملطخة ب ORO ، استخدم كاميرا قادرة على الألوان بتكبير خمسة أضعاف لتصوير عدة ديدان في مجال رؤية واحد. ثم قم بالتبديل إلى التكبير بمقدار 10 أضعاف لفحص الديدان الفردية بشكل أفضل. أخيرا ، بعد تحميل الصور على ImageJ وإنشاء مجموعة صور وفقا لبروتوكول النص ، قم بتصنيف الصور وفقا لتراكم الدهون في جميع أنحاء جسم أو في أنسجة معينة.

يشترك SKN-1 في التماثل مع الثدييات Nrf2 وقد ثبت أنه يتوسط في أكسدة الأحماض الدهنية. يوضح هذا الشكل SKN-1 المنشطة المعرضة لظروف تؤدي إلى زيادة مستويات الدهون. كما هو موضح في هذه الصور ، فإن مضان NR الذي تم التقاطه باستخدام قناة FITC GFP بارز على طول الأمعاء ، ولكنه باهت في الرأس والذيل والتجويف المعوي.

في حين أنه من السهل تصنيف الديدان وفقا لوجود أو عدم وجود استنفاد جسدي للدهون المعتمد على العمر أو ASDF ، فقد يكون من الصعب تحديد التي تعاني من فقدان الدهون المتوسط. بالمقارنة مع غير ASDF ، والتي تظهر تلطيخا أحمر فاتح في جميع أنحاء الجسم مع عدد قليل من المناطق الشفافة ، تظهر ديدان ASDF نضفادا ملحوظا للدهون في خلايا الأمعاء. غالبا ما تظهر التي تعمل في طور تطوير ASDF بقعا شفافة حيث يحدث معظم فقدان الدهون في النهاية.

علاوة على ذلك ، قد لا تزال ديدان ASDF تتميز بتلطيخ أحمر فاتح في مناطق الرأس والذيل لأن النمط الظاهري لا يتم تعريفه من خلال فقدان الدهون الجسدية بالكامل ، ولكن من خلال استنفاد الدهون بشكل كبير بالنسبة للحيوانات غير المسنة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاث ساعات بالإضافة إلى وقت التصوير إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر غسل الديدان وتغلغلها في مدة لا تزيد عن 30 دقيقة قبل تلطيخها.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري CARS لمقارنة نوع أنواع الدهون التي تحددها كل تقنية وتحديد الطريقة الأنسب لأنواع معينة من الأسئلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الدهون وتقييم توزيع الدهون في الديدان باستخدام تلطيخ Nile Red و Oil Red O ، متبوعا بتحليل الميكروغراف ImageJ.