تتبع السلوك المورفولوجية اليرقات في الاستجابة للتحفيز أوبتوجينيتيك الخلايا العصبية حاسة الشم

الهدف العام من هذه المنهجية هو تحليل السلوك الملاحي ليرقة ذبابة الفاكهة استجابة للتحفيز البصري الوراثي في نفس الوقت لعصبانها الشمية. تتيح هذه الطريقة التشريح الشامل لوظيفة دائرة حاسة الشم وتكمل الدراسات حول كيفية ترجمة وظيفة الدائرة الشمية إلى استجابة سلوكية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي خصوصيتها والتحكم الزمني باستخدام الضوء بدلا من تدرجات الرائحة التقليدية لتنشيط الخلايا العصبية الشمية الفردية.

لبدء التجربة ، قم ببناء ساحة سلوك محروم من الضوء. قم ببناء صندوق 89 × 61 × 66 سم ، مصنوع من صفائح أكريليك زجاجية سوداء اللون ، بسمك ثلاثة ملليمترات. ضع الصندوق على سطح الطاولة في غرفة السلوك.

بعد ذلك ، قم بتركيب كاميرا USB 3.0 CCD أحادية اللون مزودة بفلتر IR Longpass 830 نانومتر وعدسة تثبيت F1.4 C ثمانية ملليمترات في وسط سقف الصندوق الأسود. ضع شريطي LED بالأشعة تحت الحمراء على سطح الطاولة لإضاءة اليرقات في الساحة المظلمة. بعد ذلك ، احصل على صفيحة ألومنيوم 22 سم × 22 سم مربع لبناء منصة LED.

في وسط اللوحة ، استخدم قاطعا معدنيا لقطع ثقب كبير بما يكفي ليناسب كاميرا CCD. قم بتغطية اللوحة المعدنية بأضواء شريطية LED حمراء. قم بلحام أسلاك شريط إضاءة LED في سلسلة ، وقم بتغذية أسلاك الشريط في مرحل مقرنة بصرية يتم التحكم فيها بواسطة معالج دقيق Raspberry Pi 2B.

بعد ذلك ، قم بتركيب منصة LED حول كاميرا CCD. ثم قم بتثبيت وتكوين نظام تشغيل Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux على معالج Raspberry Pi قبل توصيل مرحل optocoupler بشرائط LED. قم بتوصيل مصدر طاقة لتشغيل شرائط LED ومقرنة البصر.

تأكد من وجود إشعاع متجانس في نقاط مختلفة حول كاميرا CCD في ساحة السلوك. تأكد من الإشعاع المطلق على سطح الساحة بمساعدة مقياس الطيف وحدده على أنه حوالي 1.3 واط لكل متر مربع في جميع أنحاء سطح الساحة. حافظ على الذباب على طعام الذباب القياسي عند 25 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية من 50 إلى 60٪ في دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة و 12 ساعة.

من أجل التعبير عن CsChrimson في زوج واحد من ORNs ، اعبر الإناث البكر من خط UAS-IVS-CsChrimson إلى الذكور من خط ORX-GAL4. بعد السماح للذباب من الذكور والإناث في صليب بالتزاوج ووضع البيض لمدة 48 ساعة ، انقل البالغين إلى قارورة جديدة. على سطح قارورة الطعام التي تحتوي على البيض ، أضف 400 ميكرولتر من خليط يحتوي على 400 ميكرومولار من الشبكية ، أو ATR ، المذاب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو DMSO ، في 89 مللي مولار سكروز مذاب في الماء المقطر.

بمجرد إضافة ATR إلى قوارير الطعام التي تحتوي على البيض ، احتضن القوارير في الظلام لمدة 72 ساعة إضافية. بعد الحضانة ، استخرج يرقات الطور الثالث من سطح طعام الذباب عن طريق تعويمها باستخدام محلول سكروز عالي الكثافة بنسبة 15٪. باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، افصل اليرقات العائمة على سطح محلول السكروز إلى دورق زجاجي سعة 1,000 ملليلتر.

اغسل اليرقات أربع مرات عن طريق تبادل 800 مل من الماء المقطر الطازج في الدورق الزجاجي في كل مرة. بعد الغسيل النهائي ، اترك اليرقات ترتاح لمدة 10 دقائق قبل إخضاعها لفحص السلوك. بالنسبة لمقايسة السلوك ، حافظ على درجة حرارة ورطوبة ثابتة في غرفة السلوك.

تحضير وسط زحف اليرقات عن طريق سكب 150 مل من الاغاروز المذاب بنسبة 1.5٪ في طبق بتري 22 سم × 22 سم مربع. اترك الاغاروز يتماسك ويبرد لمدة ساعة إلى ساعتين في أطباق بتري قبل استخدامها في مقايسة السلوك. بعد أن تصلب الاغاروز ، لا تنقل أكثر من 20 من يرقات الطور الثالث المحضرة إلى وسط طبق بتري وقم بتغطية طبق بتري بغطاءه.

ضع طبق بتري في ساحة السلوك أسفل كاميرا CCD. قم بتشغيل مصدر ضوء LED بالأشعة تحت الحمراء 850 نانومتر لتصور اليرقات في الفيديو. ابدأ تشغيل كاميرا CCD لتسجيل حركة اليرقات.

أخيرا ، انتقل إلى معالجة البيانات وتحليلها. عندما تم تحفيز ORN 7a الذي يعبر عن CsChrimson بواسطة الضوء ، كان هناك انخفاض كبير في طول التشغيل مقارنة بحيوانات التحكم. على العكس من ذلك ، عندما تم تحفيز ORN 42a الذي يعبر عن CsChrimson بالضوء ، كانت هناك زيادة كبيرة في طول التشغيل مقارنة بحيوانات التحكم.

وجدنا أنه بالنسبة ل ORN 42a ، أثارت الأنماط الزمنية المختلفة لتحفيز الضوء استجابات سلوكية مختلفة. بينما أظهرنا هذه الطريقة للخلايا العصبية المستقبلة الشمية من الدرجة الأولى ، تسمح طريقتنا أيضا بمجموعة متنوعة من التطبيقات المستقبلية ، مثل قياس تأثير الخلايا العصبية النهائية مثل الخلايا العصبية الإسقاط والخلايا العصبية المحلية على سلوك اليرقات. نتوقع أن تمهد هذه التقنية الطريق لتشريح شامل لوظيفة دائرة الشم في اليرقات.