بناء المستحثة "الببتيدات حلزونية عبر صور" ثيول-شرق/ين هيدروثيوليشن ثيوثير/"كبريتيد ثنائي الفينيل"-المربوطة

تعمل هذه الطرق على تبسيط توليد الببتيدات الحلقية المربوطة بالثيويثر بسبب استخدام كيمياء النقر thio-ene أو thio-yne التي تمتلك تسامحا فائقا للمجموعة الوظيفية وإنتاجية جيدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن حبل الثيويثر يوفر موقع تعديل لا أثر له ، مما يوسع بشكل كبير المساحة الكيميائية للببتيدات المستقرة بعد تعديل تخليق الببتيد. لبدء الإجراء ، قم بإرفاق عمود مملوء ب 50 ملليغرام من راتنج Rink Amide MBHA بكل من مشعب التفريغ الموجود على الطاولة وخط غاز النيتروجين أو الأرجون عبر محبس ثلاثي الاتجاهات.

أضف ملليلترا إلى ملليلترين من ثنائي كلورو الميثان إلى طبقة الراتنج ، وقم بتضخيم الراتنج عن طريق تحريك الخليط برفق بتيار من فقاعات الغاز الخاملة لمدة 10 دقائق. صفي الراتنج بمصباح ماصة مطاطي عند الانتهاء. ثم أضف ملليلترا إلى ملليلترين من محلول إزالة الحماية من Fmoc N-terminal إلى الراتنج.

حرك الخليط برفق عن طريق الفقاعات بالغاز الخامل لمدة 10 دقائق ، ثم صفي الراتنج باستخدام لمبة ماصة مطاطية. اغسل العمود بواحد إلى ملليلتر من DMF بنفس الطريقة ، متبوعا بواحد إلى ملليلتر من DCM. كرر تسلسل إزالة الحماية مرة واحدة.

بعد ذلك ، امزج 0.125 ملليمول من الأحماض الأمينية المحمية ب Fmoc و 50.5 ملليغرام من HCTU مع 0.5 مل من DMF في حاوية بولي بروبلين. رج الخليط لمدة دقيقة لإذابة المواد الصلبة. ثم أضف 43.5 ميكرولتر من DIPEA ، ورج الحاوية لمدة دقيقة أخرى للحصول على محلول حمض أميني منشط 0.25 مولار.

أضف هذا المحلول إلى الراتنج المغسول ، وقم بفقاعة الغاز الخامل من خلال الخليط لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك ، قم بإزالة الحماية وغسل بقايا الأحماض الأمينية المقلدة. استمر في اقتران الأحماض الأمينية بسلسلة الببتيد بهذه الطريقة لتشكيل الببتيد الخطي.

استخدم تخليق الببتيد في الطور الصلب لتحضير الراتنج الذي يدعم الببتيد الخطي الذي يتضمن بقايا السيستين المحمية بالتريتيل مفصولة بثلاث وحدات من بقايا أحادية S-five. أضف ملليلترا إلى ملليلترين من محلول إزالة الحماية من التريتيل إلى 50 ملليغرام من الراتنج الحامل للببتيد. فقاعات غاز النيتروجين من خلال الخليط لمدة 10 دقائق.

قم بتصريف محلول إزالة الحماية ، واغسل الراتنج بأجزاء من واحد إلى ملليلتر من DCM ثلاث مرات. كرر إجراء إزالة الحماية ست مرات أو حتى لا يظهر المحلول باللون الأصفر لإزالة حماية السيستين بالكامل. يعد إزالة الحماية الكاملة لمجموعة Trt من السيستين أمرا مهما جدا لخطوة التفاعل الضوئي التالية.

اغسل الراتنج بأجزاء من واحد إلى ملليلتر من DMF و DCM بالتسلسل. ثم انقع الراتنج في مل إلى ملليلتر من الميثانول لمدة دقيقتين لتقليص الراتنج. صفي الميثانول وجفف الراتنج بغاز النيتروجين لمدة خمس دقائق.

انقل الراتنج الجاف إلى قارورة دائرية القاع سعة 10 ملليلتر عبر ورق الوزن. قم بتعليق الراتنج في ملليلترين من DMF المغمور بالنيتروجين. ثم أضف 5.6 ملليغرام من MMP و 38 ملليغرام من MAP كبادئات ضوئية.

ضع قضيب التحريك في القارورة ، وقم بتغطية القارورة بحاجز مطاطي. قم بتطهير الغلاف الجوي للقارورة بغاز النيتروجين ثلاث مرات ، لمدة تطهير إجمالية تبلغ حوالي خمس دقائق. قم بإصلاح قارورة التفاعل في مفاعل ضوئي مزود بمصابيح UVA ومدخل غاز النيتروجين الخامل ولوحة التقليب.

ابدأ في تقليب الخليط وأغلق المفاعل الضوئي. تطهير المفاعل الضوئي بالأرجون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اضبط معدل تدفق الأرجون على لتر واحد في الدقيقة ، وقم بإشعاع الخليط بضوء UVA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

راقب التفاعل باستخدام HPLC. اغسل الببتيد الدوري وقطعه ونظفه عند الانتهاء. تحضير 50 ملليغرام من الراتنج الذي يحمل ببتيد خطي يتضمن بقايا أحادية S-five مستبدلة بجاما.

اغسل الراتنج باستخدام DMF و DCM بالتسلسل. تقليص الراتنج بالميثانول وجففه بغاز النيتروجين. ثم ، في قارورة دائرية القاع سعة 10 مليلتر ، قم بتعليق الراتنج في ملليلترين من DMF المملوء بالنيتروجين.

أضف إلى الخليط 5.6 ملليغرام من MMP و 3.8 ملليغرام من MAP و 25.7 ملليغرام من السيستين المحمي من Fmoc. أضف قضيب التحريك إلى القارورة ، وأغلقها بحاجز مطاطي ، وقم بتطهير جو القارورة بغاز النيتروجين. بعد ذلك ، قم بإشعاع الخليط بضوء UVA في مفاعل ضوئي خامل مملوء بغاز النيتروجين أثناء التقليب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين.

راقب التفاعل باستخدام LC-MS. عند اكتمال التفاعل الضوئي ، اغسل الببتيد المرتبط وقم بإجراء تفاعل اللبنية الكبيرة. بعد ذلك ، استأنف اقتران الأحماض الأمينية بالببتيد الدوري لتشكيل الهيكل المطلوب.

اقطع الببتيد ونقيه عند الانتهاء. تحضير 50 ملليغرام من الراتنج الذي يحمل ببتيد خطي يتضمن بقايا مع ألكين طرفي مفصول بثلاث وحدات من بقايا مع ثيول طرفي. افصل الببتيد من الراتنج ، وقم بترسيبه بملليلتر واحد من ثنائي إيثيل الأثير البارد.

الطرد المركزي خليط الببتيد في 12 ، 000 مرة غرام لمدة دقيقتين. صب المادة الطافية برفق ، وأضف ملليلتر آخر من ثنائي إيثيل الأثير البارد. كرر الغسيل مرتين أخريين ، ثم جفف بقايا الببتيد تحت الفراغ.

قم بإذابة البقايا في 50 مل من DMF المملوء بالنيتروجين في قارورة مستديرة القاع. أضف 3.2 ملليغرام من DMPA إلى محلول الببتيد ، وقم بفقاعة النيتروجين من خلال خليط التفاعل لمدة 10 دقائق. الغلاف الجوي الخامل مطلوب بشكل صارم للتفاعل الضوئي الفعال في مرحلة الحل.

خلاف ذلك ، لاحظنا أكسدة الكبريت أثناء الأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك ، قم بإشعاع الخليط بضوء UVA دون التقليب في مفاعل ضوئي خامل مملوء بغاز النيتروجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. عزل وتنقية الببتيد الدوري عند الانتهاء.

أنتجت التدوير على الراتنج لهذا الببتيد واحدا مربوطا بالثيويثر ، وخمسة ببتيد دوري بوزن جزيئي مماثل للببتيد الخطي. كان وقت الاحتفاظ ب HPLC للمنتج الدوري أقصر بدقيقتين من وقت الببتيد الخطي. لوحظ أيضا تحويل جيد لتدوير الراتنج للعديد من الببتيدات القصيرة الأخرى.

تم فحص الببتيدات الخطية للتأكد من قدرتها على الخضوع لتدبيس الببتيد عن طريق هيدروثيول الين المستحث بالضوء. يعزى العائد المنخفض البالغ اثنين من c إلى التفضيل التوافقي لمحاصرة جذر الثيل في الطرف N أثناء الانكماش إلى دورة كبيرة مكونة من 20 عضوا. أنتج كل من الببتيدات واحد أ وواحد ب اثنين من الأيزومرات مع وصلة تشابكية من ثمانية أعضاء من كبريتيد الفينيل.

كان لببتيدات المنتج اثنان من A-A واثنين A-B أوقات احتفاظ مميزة وتم إنتاجها بنسب مختلفة في أوقات تشعيع مختلفة. أشار التحليل الطيفي للبروتون بالرنين المغناطيسي النووي إلى أن اثنين من a-A هما أيزومر E لكبريتيد الفينيل واثنان من A-B هما أيزومر Z. كان أيزومر Z هو المنتج الرئيسي عند تكوين الببتيدات اثنين د واثنين e واثنين f ، والذي يعزى إلى التفضيل التوافقي أثناء تكوين الرابط المتقاطع لكبريتيد الفينيل المكون من سبعة أعضاء.

أظهر التحليل الطيفي الدائري لثنائي اللون ملفا عشوائيا لجميع أشكال الببتيدات اثنين أ واثنين ب والتشكل الحلزوني للببتيد الثاني د. قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات الكيميائية لبناء الببتيدات المربوطة بثيويثر وكبريتيد الفينيل باستخدام كيمياء النقر thio-ene و thio-yne المستحثة بالصورة. نعتقد أنه سيكون مفيدا لمجتمع البحث.