قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد قدرة الأمصال التي تم جمعها من المكاك الريسوسية المصابة بفيروس زيكا على التوسط في تعزيز الاعتماد على الأجسام المضادة لعدوى فيروس حمى الضنك في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتعزيز المعتمد على الأجسام المضادة لعدوى حمى الضنك الناجمة عن الأجسام المضادة المتصالبة التفاعلية الناجمة عن فيروس زيكا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها عالية الكثافة وبسيطة وسهلة الأداء.

سيظهر هذا الإجراء ويليام فاليانت ، طالب الدراسات العليا الناشئ في الأمراض المعدية ، في مختبري. ابدأ بإذابة عينات المصل في درجة حرارة الغرفة. عند الذوبان ، انقل 100 ميكرولتر من كل عينة مصل إلى أنبوب معقم وقم بتسخينه وتنشيطه لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لعينة المصل تتراوح من واحد إلى واحد ، إلى واحد إلى ألف في RPMI 10 البارد. ثم انقل 10 ميكرولتر من كل عينة مصل مخففة إلى آبار صفيحة معقمة 96 بئر على شكل حرف V. بعد ذلك ، قم بإذابة جزيئات حمى الضنك الأولى والثانية والثالثة والأربعة من الجسيمات الفيروسية البروبورتر في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مما يضمن حجم حوالي 170 ميكرولتر من كل RVP لكل عينة مصل.

بمجرد الذوبان ، انقل أنابيب RVPs على الفور إلى الجليد. ثم قم بسحب 10 ميكرولتر من RVPs في الآبار التي تحتوي على تخفيفات عينة مصل في آبار التحكم في المصل بدون مصل. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من خمس إلى عشر مرات.

انقل اللوحة ذات القاع الخامس سعة 96 بئر إلى حاضنة واحتضانها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أثناء احتضان اللوحة السفلية على شكل حرف V سعة 96 بئر ، قم بتنظيف سطح خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإزالة قارورة T-75 ملتصقة بالكامل من خلايا K562 من الحاضنة.

امزج الخلايا جيدا باستخدام ماصة معقمة بحجم خمسة ملليمترات وانقل خمسة ملليلتر إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، قم بإزالة 10 ميكرولترات من الخلايا من الأنبوب ، واخلطها مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق وقم بتحميلها في مقياس كثافة الدم. عد الخلايا واحسب العدد الإجمالي للخلايا.

بعد الطرد المركزي للخلايا عند 12 مائة مرة G لمدة 10 دقائق ، قم بصب المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في RPMI 10 الدافئ بتركيز 80 ألف خلية لكل 30 ميكرولتر من الوسائط. بعد إزالة اللوحة السفلية على شكل حرف V سعة 96 جيدا من الحاضنة ، انقل 30 ميكرولترا من خلايا K562 إلى كل جدار من لوحة 96 بئر V-السفلي. واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من خمس إلى عشر مرات.

ثم أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة ساعة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 12 مائة مرة G لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بصب الوسائط من الآبار عن طريق قلب اللوحة رأسا على عقب إلى حاوية تحتوي على 10٪ مبيض.

ثم اغسل الخلايا في كل جدار عن طريق إعادة تعليقها في 125 ميكرولتر من RPMI 10 الدافئ والطرد المركزي كما كان من قبل. بعد صب الغسيل الأخير ، أضف 100 ميكرولتر من RPMI 10 الدافئ إلى كل بئر. امزج لأعلى ولأسفل مع الماصة واحتضن اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد يومين ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ونقلها إلى خزانة السلامة الحيوية. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، امزج محتويات كل بئر وانقلها إلى 96 بئر صفيحة قاع U. اشطف كل بئر من اللوحة السفلية على شكل حرف V سعة 96 بسعة 100 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالدهيد و PBS وانقل الخلايا المتبقية و PBS إلى الآبار المعنية في اللوحة السفلية 96 بئر.

امزج جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. غطي الطبق بورق الألمنيوم واتركيه في الحاضنة لمدة 30 دقيقة لإصلاح الخلايا. قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل خلايا K562 غير الملوثة لمعايرة إعدادات التشتت الجانبية والأمامية باستخدام قناة الإيثيل الواحد لإزهار GFP.

ثم احصل على 30 ألفا إلى 50 ألف خلية من كل عينة. باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي ، قم بتعيين البوابة الأولى بناء على منطقة التشتت الأمامية مقابل ارتفاع التشتت الأمامي لتشمل الخلايا المفردة واستبعاد dublets الفلورية الذاتية من التحليل. احسب متوسط النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP لكل حالة ثم احسب تعزيز العدوى لكل تخفيف في المصل.

تحسين طي الرسم البياني على المحور y مقابل التخفيف على المحور x وإجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA متبوعا باختبار Tukey اللاحق للمقارنات المتعددة. يتم عرض بيانات من تمثيلي يستخدم فيروس حمى الضنك جسيمات فيروس واحد مراسل هنا. كانت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP لعينة عدم التحكم في المصل 0.253٪ كانت عينة المصل غير المخففة إيجابية 2.58٪ GFP.

وصلت نسبة الخلايا الإيجابية ل GFP إلى 12.8٪ عند تخفيف مصل واحد إلى عشرة بعد 0.735٪ عند تخفيف واحد إلى مائة و 0.022٪ عند تخفيف من واحد إلى ألف. تم فحص التعزيز المعتمد على الأجسام المضادة لعدوى حمى الضنك لأنواع الأمصال الأربعة لفيروس حمى الضنك. تظهر البيانات أن المصل الذي تم جمعه بعد 16 أسبوعا من الإصابة عزز بشكل كبير عدوى خلايا K562 بجميع أنواع أمصال فيروس حمى الضنك عند تخفيف من واحد إلى عشرة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 48 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحصول على البيانات في غضون ساعة إلى ساعتين بعد اكتمال خطوة التثبيت النهائية البالغة 30 دقيقة. لا تنس أن العمل مع المصل المصاب يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الوقاية الشخصية وممارسات مستوى BSL2 أثناء إجراء هذا الإجراء.