فحص SiRNA الإنتاجية العالية لإصابة الخلايا الظهارية الكلوروبيكرين والقرنية المستحثة بفلوريد الهيدروجين

يوضح هذا الفيديو أساليبنا لفحص siRNA عالي الإنتاجية في نموذج الخلية الظهارية للقرنية لإصابة المواد السامة. هذا العمل مهم ، لأن فحص siRNA عالي الإنتاجية هو طريقة فعالة من حيث التكلفة وفعالة من حيث الوقت لتوضيح مسارات ومنظمات الاستجابة الخلوية للمواد السامة. قد يساعد هذا العمل في زيادة فهمنا لكيفية استجابة القرنية للإهانات السامة.

تحضير معلق للخلايا الظهارية للقرنية في وسط دافئ مسبقا يحتوي على 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر هيدروكورتيزون في زجاجة متوسطة يمكن التخلص منها. قم بتدوير الزجاجة لتعليق الخلايا بالتساوي ، واسكبها في خزان على عش الخلاط المداري لمعالج السوائل الآلي. احتفظ بتعليق الخلية على لوحة تسخين بزاوية 37 درجة أثناء عملية طلاء الخلية.

استخدم معالج السوائل الآلي لإضافة خلايا إلى الألواح بكثافة ألف خلية لكل بئر في 70 ميكرولترا من الوسط لكل بئر على صفيحة 96 بئرا. قم بزرع ما لا يقل عن 14 لوحة 96 بئرا مع خلايا لكل لوحة مكتبة siRNA لدراستها. قم بتشغيل شاكر المداري بسرعة 100 دورة في الدقيقة باستمرار أثناء عملية البذر، واستخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات.

امزج تعليق الخلية باستخدام معالج السوائل الآلي قبل بذر اللوحة الأولى. استنشق 140 ميكرولترا من تعليق الخلية ، وقم بتوزيع 70 ميكرولترا في كل بئر من لوحين لزراعة الخلايا. كرر الخلط والاستغناء حتى يتم زرع جميع الأطباق بالخلايا.

أعد ملء خزان تعليق الخلية حسب الحاجة. بعد زرع الألواح ، أخرجها من معالج السائل واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم انقلها إلى حاضنة زراعة الخلايا.

قم بتقييم كثافة الخلايا لجميع الألواح في صباح اليوم التالي باستخدام نظام التصوير الآلي الموجود في حاضنة زراعة الخلايا. استبعاد الألواح من الدراسة التي تحتوي على آبار داخلية لا تتراوح بين 15 في المائة و 22 في المائة. قم بنقل الخلايا بعد 24 ساعة من البذر بأربعة بيكومولات لكل بئر من siRNA و 0.3 ميكرولتر لكل بئر من كاشف النفقة ، على النحو التالي.

احصل على لوحات مكتبة siRNA من البائع ، والتي تم تكوينها لتحتوي على 80 هدفا من أهداف siRNA لكل لوحة مع ترك العمود الأول والثاني عشر فارغين. أعد تكوين لوحة مكتبة siRNA مع عازلة siRNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للتركيز النهائي لاثنين من البيكومولي لكل ميكرولتر لكل بئر من siRNA. قم بإجراء جميع عمليات النقل باستخدام معالج السوائل الآلي وسرعة سحب العينات 25 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات.

استخدم صناديق الإكرامية المكونة مسبقا لمعالجة الآبار التي سيتم نقلها فقط. استخدم النصف العلوي من لوحة المكتبة لنقل مجموعة من ست لوحات مكررة ، يشار إليها باسم مجموعة اللوحة العلوية "استخدم النصف السفلي من لوحة المكتبة لنقل مجموعة مختلفة من ست لوحات متماثلة ، يشار إليها باسم مجموعة الألواح السفلية "معا ، تتكون اللوحات الاثني عشر من مجموعة كاملة من اللوحات ، وتحتوي كل لوحة خلوية على نفس مجموعة عناصر التحكم. الآبار الشفافة B2 إلى B6 من جميع الصفائح ذات siRNA السلبية بعد أن تم نقل جميع مجموعات الألواح العلوية والسفلية باستخدام مكتبة siRNA.

أيضا transfect آبار B2 إلى B6 من اثنين آخرين صفيحتين لا يتلقان مكتبة siRNA مع بركة سلبية siRNA. ستكون هذه بمثابة ضوابط غير مكشوفة. احتضان جميع ألواح الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة أربع ساعات بعد إضافة خلطات التعدي ، واخلطها عن طريق النقر اللطيف كل ساعة.

استخدم معالج سائل آلي لغسل الألواح مرتين بوسط مسخن مسبقا ، مخفف من واحد إلى خمسة في PBS وإعادة تغذيته ب 100 ميكرولتر لكل وسط دافئ مسبقا. استخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات. استخدم الآبار C2 إلى C6 كضوابط غير منقولة.

احتفظ بالآبار من B7 إلى B11 و C7 إلى C11 غير منقولة ، لاستخدامها كأدوات تحكم في المخدرات والمركبات للتعرض للمواد السامة. بعد 24 ساعة من التعداء ، استخدم معالج السوائل الآلي لإعادة تغذية الألواح. استخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات.

استنشق 100 ميكرولتر من كل بئر ، وتخلص منها في خزان النفايات. أعد تغذية كل بئر ب 100 ميكرولتر لكل بئر H-Cort.medium دافئ مسبقا. أفرغ خزان النفايات حسب الحاجة.

أعد ملء الخزان بوسيط حسب الحاجة. بعد يومين من التعدي وقبل ساعتين من التعرض ، قم بإعداد محلول 62.5 ميكرومولار للتحكم الإيجابي في H-Cort. متوسطة ، وأضفها إلى الصف B من خزان التخفيف المكون من 8 صفوف.

قم بإعداد محلول 06.25 بالمائة من DMSO في H-Cort. متوسط ، وأضفه إلى الصف C من نفس الخزان. يستخدم DMSO كعنصر تحكم في السيارة.

استخدم معالج السوائل الآلي لإزالة 10 ميكرولتر من الوسط من الآبار B7 إلى B11 و C7 إلى C11 من كل لوحة خلية ، وتخلص منها في الصفين G و H من الخزان. تأكد من استخدام صناديق الأطراف المعدة مسبقا لمعالجة تلك الآبار التي ستتلقى عناصر التحكم الإيجابية وعناصر التحكم في السيارة فقط، واستخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات. انقل 10 ميكرولترات من أدوات التحكم الإيجابية وأدوات التحكم في السيارة إلى تلك الآبار ، واخلطها ثلاث مرات.

أعد لوحات الخلايا هذه إلى الحاضنة. كرر هذه الخطوات لجميع لوحات الخلايا الإضافية. قم بإجراء جميع عمليات التعرض للمواد الكيميائية في غطاء الدخان الكيميائي ، وارتداء قفازات النتريل المزدوجة ، ومعطف المختبر ، وواقيات الأكمام المصنوعة من البولي إيثيلين التي تستخدم لمرة واحدة ، ونظارات السلامة.

تطهير أطراف الماصة والخزانات التي لامست حمض الهيدروفلوريك ، وأي حمض هيدروفلوريك سائل يحتوي على 2.5 في المائة من غلوكونات الكالسيوم قبل التخلص منها في مجرى النفايات الخطرة. لكل لوحة مكتبة قيد الفحص ، قم بإعداد محلول متوسط حمض الهيدروفلوريك بنسبة 0.0036 في المائة عن طريق إضافة 288 ميكرولتر من حمض الهيدروفلوريك بنسبة واحد في المائة إلى 80 مل من H-Cort الدافئ مسبقا. متوسطة في زجاجة 150 مل.

قم بتدوير الزجاجة واحتضان حمض الهيدروفلوريك المخفف في حاضنة 37 درجة في غطاء الدخان الكيميائي لمدة عشر دقائق. أضف محلول وسط حمض الهيدروفلوريك إلى خزان كاشف على جهاز تسخين اللوحة. قم بإجراء التعرض مع اثنين من الفنيين يعملان جنبا إلى جنب.

اطلب من الفني الموجود على اليمين إزالة وسط زراعة الخلايا من لوحة الخلية باستخدام ماصة ذات اثني عشر قناة ، ثم قم بتمرير اللوحة إلى الفني على اليسار. اطلب من الفني الموجود على اليسار إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول حمض الهيدروفلوريك المتوسط. كرر هذه العملية لجميع صفائح الخلايا التي ستتعرض للمواد السامة.

كرر أيضا هذه العملية للوحات التحكم غير المكشوفة ، باستخدام وسيط جديد بدلا من محلول حمض الهيدروفلوريك. ضع الألواح في حاضنة شفط الدخان الكيميائي لمدة 20 دقيقة ، ثم أعدها إلى حاضنة زراعة الخلايا. كرر خطوة إضافة التحكم الإيجابي كما هو موضح سابقا ، بمجرد تعرض جميع الألواح وإعادتها إلى حاضنة زراعة الخلايا.

اجمع المادة الطافية لزراعة الخلايا وقم بتقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة MTT بعد 24 ساعة من التعرض. تحضير محلول من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر MTT الركيزة في PBS تحتوي على 10 غرامات لكل لتر من الجلوكوز, ودافئ إلى 37 درجة. أضف محلول الركيزة MTT إلى خزان على معالج سائل آلي.

استخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات. قم بتكوين مربعات الإكرامية مسبقا لمعالجة تلك الآبار المراد فحصها فقط. استخدم معالج السوائل الآلي لشفط 95 ميكرولترا من الوسط من البئرة ال 60 الداخلية للوحة الخلية ، وقم بإيداع 42.5 ميكرولترا في كل من لوحين للتخزين سعة 384 بئرا.

أضف على الفور 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الركيزة MTT إلى ألواح الخلايا ، واحتضانها عند 37 درجة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة. أغلق ألواح التخزين المكونة من 384 بئرا ، وقم بتخزينها عند 80 تحت الصفر لتحليلها لاحقا. كرر هذه العملية لجميع مجموعات الألواح العلوية والسفلية وعناصر التحكم غير المكشوفة المرتبطة بها.

أعد ملء خزان الركيزة MTT حسب الحاجة. أعد استخدام الأطراف بين التكرارات إذا رغبت في ذلك ، ولكن اغسلها عند إضافة محلول الركيزة MTT وعند التبديل بين مجموعات الألواح. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، استخدم معالج السوائل الآلي لإزالة محلول الركيزة MTT من 60 بئرا داخليا لكل لوحة زراعة خلية ، واستبدلها ب 100 ميكرولتر لكل بئر من DMSO.

استخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات، وقم بتكوين صناديق الأطراف مسبقا لمعالجة تلك الآبار المراد فحصها فقط. أفرغ خزان النفايات وأعد ملء خزان DMSO حسب الحاجة. رج الأطباق على شاكر الطبق لمدة ثلاث دقائق.

قم بقياس الامتصاص عند 570 و 690 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للوحة. اطرح امتصاص الخلفية عند 690 نانومتر من الامتصاص عند 570 نانومتر ، ومتوسط قيم كل مجموعة تحكم على اللوحة غير المكشوفة. احسب النسبة المئوية للجدوى بقسمة قيم الامتصاص لكل هدف على متوسط قيمة الامتصاص لعناصر التحكم غير المكشوفة.

استخدم متوسط التجمع السلبي غير المكشوف لحساب النسبة المئوية لصلاحية الخلية لجميع الأهداف. قم بقياس تركيز IL-8 في المواد الطافية لزراعة الخلايا باستخدام مقايسة قائمة على الخرز بدون غسل، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإنشاء تخطيط لوحة فحص لاستيعاب العينات والمعايير.

قم بإزالة ألواح التخزين التي تبلغ 384 بئرا من الفريزر 80 تحت الصفر ، وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. باختصار ، قم بالطرد المركزي للألواح لجمع العينة في قاع الآبار. أضف حبات المستقبل المضادة ل IL-8 والجسم المضاد البيوتينيل إلى لوحة تخزين سوداء 384 بئرا.

أضف خليط الخرزة والأجسام المضادة إلى الآبار المخصصة للاستخدام في العينات والمنحنى القياسي ، وفقا لتخطيط لوحة الفحص. أعد تكوين المعيار في وسط يحتوي على 354 ميكرومولار كلوريد الصوديوم. قم بعمل تخفيفات تسلسلية مزدوجة للمنحنى القياسي ، وأضف ثلاث نسخ إلى لوحة تخزين سوداء مختلفة 384 بئرا.

استخدم معالج سائل آلي لإجراء المقايسة. استخدم صناديق الأطراف المكونة مسبقا لمعالجة الآبار وفقا لتخطيط لوحة المقايسة. استخدم سرعة سحب ماصة تبلغ 50 ميكرولتر في الثانية لجميع الخطوات.

انقل 8 ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة للحبة المستقبلة إلى ألواح فحص البئر الضحلة البيضاء المكونة من 384 بئرا. أضف خليط الأجسام المضادة للحبة إلى الآبار المخصصة للاستخدام للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط لوحة الفحص. بعد ذلك ، قم بنقل المنحنى القياسي إلى الآبار المناسبة على ألواح فحص الآبار الضحلة.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول كلوريد الصوديوم 3.54 مولار في خزان ضحل. اضبط تركيز الملح في العينات ليتناسب مع تركيز المنحنى القياسي عن طريق نقل 4.5 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم إلى العينات الموجودة في ألواح التخزين السوداء المكونة من 384 بئرا. امزج العينات ثلاث مرات باستخدام حجم خلط 30 ميكرولتر ، ثم انقل ميكرولترين من العينات إلى ألواح فحص البئر الضحلة البيضاء وفقا لتخطيط لوحة الفحص.

احتضن لمدة ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. أضف حبات ثانوية إلى لوحة تخزين سوداء سعة 384 بئرا. أضف الخرزات إلى الآبار المخصصة للاستخدام في العينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط لوحة الفحص.

انقل 10 ميكرولترات من الخرزات الثانوية إلى آبار لوحة فحص البئر الضحلة البيضاء المكونة من 384 بئرا والتي ستتلقى منحنى قياسيا أو عينات وفقا لتخطيط لوحة الفحص. اغسل الأطراف بين كل طبق. احتضن لمدة ساعة أخرى في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

أغلق لوحات الفحص بأختام لوحة شفافة ، وقم بالمسح الضوئي باستخدام قارئ لوحة متوافق مع الفحص القائم على الخرز. استخدم مسافة 0.2 ملم بين اللوحة والكاشف ، ووقت إثارة 180 مللي ثانية للمسح ، ووقت قياس 550 مللي ثانية. قم باستيراد البيانات الأولية من فحوصات IL-8 إلى جدول بيانات.

استخدم تركيب المنحنى الآلي للمنحنى القياسي لمقايسات IL-8 ، ثم قم بتحويل البيانات الأولية إلى بيكوغرام لكل مليلتر لكل عينة. احسب متوسط التكرارات الستة لكل هدف. بعد ذلك ، احسب قيم SSMD وتغيير الطي بالنسبة لعناصر التحكم السلبية المكشوفة.

اعرض البيانات في مخطط مصباح يدوي مزدوج ، والذي يوضح تغيير الطية على طول المحور x و SSMD على طول المحور y ، لكل هدف. في الختام ، قمنا بتطوير طرق وظروف استزراع مناسبة لدراسة الفحص عالي الإنتاجية لإصابة العين بواسطة المواد السامة. لقد أثبتنا فائدة هذه الطرق من خلال إكمال الشاشة الأساسية لمكتبة siRNA في نموذج لإصابة حمض الهيدروفلوريك.

يمكن أن تساهم مجموعات البيانات الجينومية عالية الإنتاجية بشكل كبير في فهم الدور الذي تلعبه جينات معينة في الإصابة أو المرض ، مما قد يساعد في تركيز دراسات المتابعة في المختبر أو في الجسم الحي بشكل أكثر كفاءة.