الكشف عن حساسية عالية من ميكروميتاستاسيس المتولدة عن التجارة والنقل ترانسدوسيد لينتيفيروس أورجانويدس مثقف من ورم القولون المستمدة من المريض

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الورم حول النقائل الدقيقة الموجودة في مريض سرطان القولون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالكشف عالي الحساسية عن النقائل الدقيقة التي تسببها عضيات سرطان القولون المشتقة من المريض في الفئران. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه قد يكون من الصعب اكتشاف النقائل الدقيقة المشتقة من ورم القولون العضوية في الأعضاء البعيدة في الفئران.

سيظهر الإجراء مع يو أوكازاوا كوسوكي ميزوكوشي ويو كوياما ، كلاهما من طلاب الدكتوراه والجراحين من مجموعتي. لتوليد عضيات الخلايا السرطانية للقولون والمستقيم البشري ، أضف أولا 150 ميكرولترا من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية لكل بئر إلى صفيحة مكونة من 12 بئرا على الجليد. عندما يتم طلاء جميع الآبار ، احتضان اللوحة لمدة 30 إلى 60 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لترسيخ المواد الهلامية.

بعد ذلك ، قم بتعليق حبيبات خلية الطعم الغريب المشتقة من المريض في وسط ثقافة عضية لسرطان القولون والمستقيم طازج مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 5٪ ، أو FCS ، لتحقيق ثلاثة أضعاف 10 إلى خمس خلايا لكل تركيز مليلتر ، وبذر ملليلتر واحد من الخلايا على كل مصفوفة اصطناعية خارج الخلية. ثم أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، قم بنقل المواد الطافية للثقافة بعناية ، بما في ذلك الخلايا العائمة ، إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر لطردها المركزي ، وأعد تعليق الكريات في 70 ميكرولترا من المصفوفة الاصطناعية الطازجة خارج الخلية على الجليد.

لزيادة قابلية الخلايا السرطانية في القولون والمستقيم ، قم بتراكب الخلية السرطانية العائمة التي تحتوي على مصفوفة اصطناعية خارج الخلية مرة أخرى على الآبار الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية ، واحتضان مزارع الخلايا السرطانية لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. عندما يتجمد جل المصفوفة خارج الخلية الجديد ، قم بتغذية الثقافات بملليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا العضوية لسرطان القولون والمستقيم الطازج المكمل بنسبة 1٪ FCS ، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد سبعة إلى 10 أيام من الثقافة ، افصل العضيات ميكانيكيا باستخدام مكشطة خلية معقمة ، وانقل العضيات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر لطردها المركزي.

بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من PBS مع النقر اللطيف لجهاز طرد مركزي آخر. لفصل عضيات سرطان القولون والمستقيم ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الإنزيم المحلل للبروتين والتحلل الكولاجيني إلى الأنابيب ، واخلطه مع النقر اللطيف. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط المكمل بنسبة 1٪ FBS إلى الخلايا ، وقم بماصة تعليق الخلية برفق عدة مرات لتفتيت العضيات.

سحب العينة اللطيف لعضويات CRC البشرية أثناء المعالجة أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على تكوين كروي سليم في الثقافة. الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من مخزون الفيروسات العدسية 5X GFP و 400 ميكرولتر من وسط الثقافة العضوية لسرطان القولون والمستقيم الطازج. من الضروري إصابة عضيات CRC البشرية بعيار عال من فيروس العدسات GFP ، لا سيما لتحقيق ما يقرب من 100٪ من عدوى CRC.

اضبط الحجم في كل أنبوب لتحقيق خمسة أضعاف 10 إلى خمس خلايا سرطانية منفصلة لكل 500 ميكرولتر من التركيز المتوسط ، وقم بلوحة 500 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من صفيحة اصطناعية مصفوفة خارج الخلية مطلية بمصفوفة 12 بئرا كما هو موضح. بعد 18 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا ، قم بنقل المواد الطافية العائمة المحتوية على الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 مليلتر للطرد المركزي ، متبوعة بإعادة تعليق الكريات في 70 ميكرولترا من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية لكل أنبوب على الجليد. لتعزيز صلاحية خلايا سرطان القولون والمستقيم ، قم بتراكب المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية المحتوية على الخلايا السرطانية على عضيات الورم في اللوحة المكونة من 12 بئرا ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة.

عندما يتجمد طلاء المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ، قم بتغذية المزارع بملليلتر واحد من وسط الاستزراع العضوي الطازج CRC المكمل بنسبة 1٪ FCS ، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك ، راقب الخلايا المصابة عن طريق الفحص المجهري الفلوري لتأكيد إيجابية GFP بنسبة 100٪ تقريبا ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة أربعة إلى ستة أيام أخرى. لإنشاء نموذج فأر ورم خبيث تلقائي لطعوم الورم الغريبة المشتقة من مريض CRC ، قم بفصل العضيات المسماة GFP كما هو موضح ، وقم بتخفيف معلقات الخلايا السرطانية المفردة بخمسة أضعاف 10 إلى خمس خلايا سرطانية لكل 50 ميكرولترا من PBS مكملة بتركيز مصفوفة اصطناعية خارج الخلية بنسبة 50٪.

قم بتحميل 50 ميكرولترا من الخلايا لكل فأر في حقنة مجهزة بإبرة قياس 22 ، وضع الخلايا السرطانية على الجليد. بعد ذلك ، تأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، وضع أول فأر مخدر في وضع ضعيف على مقعد المختبر. باستخدام ملاقط معقمة ، اسحب الغشاء المخاطي للمستقيم برفق من فتحة الشرج ، وحقن الخلايا السرطانية على الفور في تحت الغشاء المخاطي للمستقيم.

لإنشاء نموذج ورم خبيث تجريبي لطعوم الورم الغريبة المشتقة من مريض CRC ، قم بتخفيف معلقات الخلايا السرطانية المفردة بأربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الأربع لكل تركيز 50 ميكرولتر ، وقم بتحميل 50 ميكرولترا من الخلايا لكل فأر في حقنة مجهزة بإبرة قياس 22. ضع أول فأر مخدر في وضع الانبطاح على المقعد ، وقم بعمل شق صغير في المنطقة السفلية من الجناح الأيسر. استخدم مقصا وملاقط معقمة لقطع الصفاق بعناية وفضح الطحال ، واستخدم الملقط لالتقاط الدهون المرتبطة بالطحال.

بعد ذلك ، قم بحقن 50 ميكرولترا من تعليق الخلية السرطانية ببطء في الطحال ، مع الحرص على عدم ملاحظة أي تسرب. بعد حقن جميع الفئران وخياطتها حسب الضرورة ، أعد إلى أقفاصها المنزلية ، وتحقق من تسرب الخيط وقابليته للحياة بعد يوم واحد من ولادة الخلايا السرطانية. استخدم الفرجار لقياس الأورام أسبوعيا ، وحصاد الأورام الأولية والأنسجة ذات الصلة حتى نقاط النهاية التجريبية المناسبة.

انقل الأورام والأعضاء التي تم تشريحها إلى خمسة ملليلتر من PBS المثلج في طبق بتري طوله 10 سم على الجليد ، وراقب الأنسجة المقطوعة تحت مجهر فلوري مجسم لتقييم تعبير GFP الخاص بها. تؤدي العدوى العضوية CRC بفيروس العدسات GFP ، كما هو موضح ، إلى أن جميع العضيات تقريبا تعبر عن GFP ساطع للغاية. يكشف الحقن التقويمي وداخل الطحال للعضيات المسماة GFP في الفئران المتلقية الثانوية NOG عن تكوين أورام أولية إيجابية ل GFP في موقع تقويم العظام ، وكذلك في رئتي غالبية الفئران التي تم فحصها بعد 2.5 شهر من الحقن.

علاوة على ذلك ، لوحظت نقائل الكبد في NOG المتلقية بعد شهر واحد من الحقن داخل الطحال. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف النقائل الدقيقة لعضيات خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية المسماة GFP بعد إدخالها في الفئران المتلقية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كفاءة توجيه الورم والورم الخبيث لحضيات خلايا سرطان القولون البشري في الفئران تعتمد إلى حد كبير على تباين الخلايا السرطانية الأصلية بين المستشفى.