التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

يمكن استخدام حقن إينتراسبينال recombinase تعتمد المؤتلف المرتبطة بالغدة الفيروس (راف) التعامل مع أي نوع من الخلايا المسمى وراثيا في الحبل الشوكي. هنا ونحن تصف كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني. هذا الأسلوب يتيح للاستجواب الوظيفي من النوع الفرعي العصبية التلاعب بها.

الهدف العام من التوصيل داخل العمود الفقري للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلفة هو تمكين وضع العلامات النسيجية والتلاعب الوظيفي بالخلايا العصبية المحددة وراثيا في الحبل الشوكي الظهري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الألم ، مثل الدوائر العصبية المطلوبة لإدراك طرائق الألم المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التلاعب بالخلايا العصبية المصنفة وراثيا بطريقة مقيدة بشكل خاص ويتم التحكم فيها مؤقتا.

حدد موقع زوج الأضلاع الذيلية عن طريق ملامسة العمود الفقري للفأر المخدر. بعد ذلك ، قم بعمل قطع طولي من 1.5 إلى 2.5 سم في الجلد ، بدءا من المنقار فقط إلى زوج الأضلاع الذيلي. ارفع الجلد بالملقط وافصله عن العضلة الأساسية بالمقص.

طوال الجراحة ، حافظ على رطوبة الأنسجة المكشوفة باستخدام كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. باستخدام ملقط دقيق ومقص صغير ، قم بعمل شق في الطبقة الغشائية الرقيقة المجاورة ، بجوار خط الوسط مباشرة ، واقطعها بعيدا عن العمليات الشائكة. يمكن أن تساعد العديد من المعالم التشريحية في تحديد الفقرات الصحيحة التي يجب استهدافها.

هنا ، نصف ثلاثة بدائل. جس على طول العمود الفقري. يقع زوج الأضلاع الذيلية فقط في الفقرات المنقارية T13 وعظم الحوض على مستوى الورك على مستوى الفقرات L6.

بدلا من ذلك ، اسحب الجلد للخلف باتجاه الذيل لكشف القمة الحرقفية. على نفس المستوى ، ينضم الزوج الأكثر ذيلية من الأربطة المستعرضة المرئية إلى عملية العمود الفقري L6. العد التنازلي في الاتجاه الذيلية إلى المنقاري لتحديد الفقرات ذات الاهتمام.

خلاف ذلك ، حدد المكان الذي يكون فيه الوتر على طول جانب العمود الفقري أكثر بياضا وأكثر وسطا. تقع فقرات T13 فقط. يقع الجزء من الحبل الشوكي القطني L4 داخل هذه الفقرات.

بعد ذلك ، ضع على وسادة من الأنسجة الملفوفة لرفعه إلى المشابك الشوكية للإطار التجسيمي. قم بمحاذاة المشابك المجاورة للفقرات المستهدفة. قم بتثبيت مشبك واحد في موضعه ، ثم أمسك العمود الفقري باستخدام ملقط Adson أثناء تثبيت المشبك الثاني.

تأكد من التثبيت المناسب عن طريق الضغط بعناية على الفقرات المستهدفة. ثم قم بإزالة العضلة الطفيلية فوق الفقرات ذات الاهتمام. أولا ، قم بعمل شق وسطي للأوتار الموازية للعمود الفقري.

ثم قم بعمل شقوق عمودية منقارية وذيلية على الفقرات المستهدفة. بعد ذلك ، استخدم rongeurs لتمزيق أو قطع العضلة الطفيلية فوق الفقرات ذات الاهتمام. استخدم الملقط حسب الحاجة لإزالة الأنسجة المتبقية على الفقرات أو فوق الجافية في الفضاء داخل الفقر.

يجب أن يكون الوعاء الدموي الظهري مرئيا الآن ، مما يشير إلى خط الوسط للحبل الشوكي. بالنسبة للحقن من جانب واحد ، قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الجزئي باستخدام مثقاب طبيب أسنان جيد مزود بقاطع كروي 0.5 ملم لحفر ثقب بعناية فائقة في منتصف الجانب المستهدف من الفقرات. قم بإزالة أي شظايا عظمية متبقية بإبرة مشطوفة عيار 26 لكشف الحبل الشوكي.

استخدم الإبرة لثقب الجافية في الفراغات داخل الفقرات المنقارية والذيلية إلى الفقرات المستهدفة ، حوالي 300 ميكرون جانبي للأوعية الدموية الظهرية. ثم قم بثقب الجافية أسفل الحفرة المحفورة. في هذه المرحلة ، يجب أن يهرب السائل النخاعي من الثقوب ويجب أن ينتفخ الحبل الشوكي قليلا.

قم بإعداد حقنة الحقن عن طريق تركيب الشعيرات الدموية الزجاجية أولا على حقنة ميكرولتر. اربط الجوز بإحكام لضمان ملاءمة محكمة وآمنة. املأ حقنة الميكرولتر بالماء المقطر المعقم ، ثم اضغط على المكبس.

إذا لم يتم طرد الماء بسهولة من الحافة ، فمن المحتمل أن تكون الماصة الدقيقة مسدودة ويجب استبدالها. قم بتركيب المحقنة على معالج دقيق متصل بحاقن دقيق يتم التحكم فيه إلكترونيا. بعد ذلك ، استخدم الحاقن الدقيق لسحب حوالي ميكرولتر واحد من الهواء لفصل الماء عن الفيروس.

بعد ذلك ، قم بوضع ماصة قطرة 2.5 ميكرولتر من محلول الفيروس المخفف على قطعة من فيلم البارافين. حرك طرف الماصة الدقيقة بعناية إلى القطرة باستخدام الإطار الفراغي واسحبه لأعلى في الماصة الدقيقة. ثم اضغط على الاستغناء حتى تظهر قطرة من محلول الفيروس عند الحافة.

اسحب المحقنة واستخدم قلما لتمييز الماصة الدقيقة بمقياس لمراقبة الحجم الذي تم توزيعه. استخدم الذراع التجسيمية لتحريك طرف الماصة الدقيقة فوق أحد الثقوب الموجودة في الجافية ثم لأسفل حتى يظهر انخفاض طفيف على سطح الحبل الشوكي المكشوف. لاستهداف الحقن في القرن الظهري الشوكي ، حرك الطرف لأسفل إلى عمق 500 ميكرون بزيادات قدرها 100 ميكرون ثم حتى 200 ميكرون للسماح بالتثبيت الميكانيكي للأنسجة.

العمق النهائي للطرف هو 300 ميكرون. بعد برمجة المضخة لحقن 300 نانولتر بسرعة حقن 50 نانولتر في الدقيقة ، اضغط على زر البدء لبدء التسريب. بعد اكتمال الحقن، تحقق من الميزان الموجود على الماصة الدقيقة لمعرفة ما إذا كان مستوى الفيروس قد انخفض.

اترك الماصة الدقيقة في مكانها لمدة ثلاث دقائق إضافية للسماح للضغط بالتوازن. بعد ثلاث دقائق، اسحب الماصة الدقيقة ببطء ثم كرر الإجراء لموقعي الحقن الآخرين. بعد الحقن النهائي ، قم بإزالة المشابك الشوكية والوسادة الموجودة أسفل الماوس.

أغلق طبقات الشق بغرز متقطعة ، وخياطة طبقات الأنسجة السطحية بخيوط قابلة للامتصاص والجلد بخيوط غير قابلة للامتصاص. ضع مطهر اليود على الجرح المخيط. قم بإنهاء التخدير واترك على حصيرة الحرارة حتى يتعافى قبل إعادته إلى قفص منزله.

فحص أنسجة العمود الفقري في موقع الحقن في نهاية التجربة. يعد ذلك ضروريا للتحقق من نجاح الحقن والتنبيغ واستبعاد تلف الأنسجة المفرط نتيجة الجراحة. لتوضيح مستويات التعبير التي يمكن الحصول عليها عن طريق الحقن داخل العمود الفقري ل AAV المؤتلف ، تم حقن فيروس يشفر بروتين الفلورسنت eGFP في الحبل الشوكي القطني للفئران البرية.

أنتجت ثلاث حقن متباعدة ملليمتر واحد تقريبا عدوى مستمرة تقريبا في أجزاء العمود الفقري القطنية من L3 إلى L5. يؤدي حقن الفيروس على عمق 300 ميكرون من سطح العمود الفقري إلى عدوى سائدة في الخلايا في القرن الظهري للحبل الشوكي. ومع ذلك ، يمكن أيضا العثور على الخلايا المصابة في القرن البطني. تم حقن ناقل مرن يعتمد على cre يعبر عن eGFP في الحبل الشوكي للفئران المعدلة وراثيا GlyT2: Cre.

أدى ذلك إلى تعبير eGFP أكثر تقييدا مما يعكس توزيع الخلايا العصبية الإيجابية GLYT2. سيسمح اتباع هذا البروتوكول باستهداف ثلاثة أجزاء متتالية من العمود الفقري. وجدنا أن هذا كاف للحصول على نتائج سلوكية قوية.

ستسمح هذه التقنية بدراسة وظيفة الخلايا العصبية ومجموعات الخلايا المحددة والمسارات الحسية.