توليف للأنابيب النانوية الكربونية متعددة الجدران تعديل مع جسيمات فضة نانوية وتقييم الخصائص السامة للخلايا والأنشطة المضادة للبكتيريا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مجمعات نانوية مضادة للبكتيريا تتكون من أنابيب نانوية كربونية مع جزيئات نانوية من الفضة يتم تصنيعها على أسطح الأنبوب النانوي. يمكن استخدام هذه الطريقة في تطوير مواد نانوية بكتيرية جديدة ذات سمية منخفضة للإنسان مع وجود خصائص إنزانية قوية لأنواع مختلفة من البكتيريا والأغشية الحيوية. يصف البروتوكول تقييم المجمعات النانوية في القضاء على البكتيريا مع الحفاظ على قابليتها للمقارنة الحيوية مع البشر.

لبدء الإجراء ، ضع 30 إلى 50 ملليغرام من MWCNTs في قارورة سعة 50 ملليلترا. باستخدام ماصة دقيقة مزودة بأطراف ماصة واحدة من المليلتر ، أضف ببطء ثمانية ملليلتر من محلول ثلاثة إلى واحد من حمض الكبريتيك وحمض النيتريك إلى MWCNTs. انتظر 30 دقيقة حتى ينتهي التفاعل الطارد للحرارة ، ثم قم بصوتنة المحلول عند 60 إلى 80 درجة مئوية و 160 واط حتى تستقر MWCNTs في الجزء السفلي من القارورة ، والتي تستغرق عادة حوالي ساعة واحدة.

انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي. استخدم ماصة دقيقة لإضافة 30 مل من الماء المقطر بعناية إلى MWCNTs الوظيفية بحمض الكربوكسيل ، مع التوقف مؤقتا للسماح للخليط بالتبريد حسب الحاجة. ثم ، قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مزودة برأس ماصة سعة مليلتر واحد. أضف خمسة ملليلتر من الإيثانول إلى المادة الصلبة واشطف جدران القارورة بالإيثانول الإضافي. قم بالطرد المركزي للخليط مرة أخرى بنفس الإعدادات وتحقق من درجة الحموضة للمادة الطافية باستخدام ورق الأس الهيدروجيني.

استمر في غسل المواد الصلبة عن طريق الطرد المركزي في الإيثانول حتى يصبح الرقم الهيدروجيني الطافي محايدا ، ثم قم بإزالة المادة الطافية وأضف ملليلترا واحدا من الماء المقطر إلى الراسب. قم بتفريق MWCNTs الوظيفية بحمض الكربوكسيل في الماء وتجميد تجفيف التشتت عند 60 درجة مئوية تحت الصفر تحت الفراغ. ضع 10 ملليغرام من حمض الكربوكسيل المجفف المجفف في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.

أضف 30 مل من الماء المقطر إلى الأنبوب. امزج ستة ملليلتر من نترات الفضة العادية 0.1 و 18 مل من الماء المقطر في أنبوب مخروطي آخر سعة 50 مل. قم بتقطيع كلا الخليطين عند 60 درجة مئوية و 160 واط لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، مع الاستمرار في صوتنة تشتت MWCNT عند 60 درجة مئوية و 160 واط ، أضف محلول نترات الفضة إلى تشتت MWCNT باستخدام ماصة مجهزة بطرف ماصة مليلتر واحد. بمجرد اكتمال الإضافة ، استمر في صوتنة الخليط لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 15 دقيقة عند 12 ، 000 جم في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تشتيت MWCNTs الفضية في 30 مل من الماء المقطر عن طريق صوتنة عند 24 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

كرر الطرد المركزي في 30 مل من الماء المقطر وإزالة المادة الطافية مرتين. بعد ذلك ، قم بتفريق MWCNTs الفضية المغسولة في ملليلتر واحد من الماء المقطر عن طريق الصوتنة لمدة خمس دقائق. أضف خمسة ملليلتر من الإيثانول إلى التشتت وحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

ثم قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 15 دقيقة عند 12،000 جم في درجة حرارة الغرفة وتحقق من درجة الحموضة للطاف. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تشتيت الخليط في خمسة ملليلتر من الإيثانول عن طريق الدوامة. استمر في غسل الراسب في الإيثانول عن طريق الطرد المركزي حتى يصبح الرقم الهيدروجيني الطافي محايدا.

أخيرا ، قم بتفريق MWCNTs الفضية المغسولة في مليلتر واحد من الماء المقطر. قم بتجميد تجفيف التشتت عند 70 درجة مئوية تحت الصفر تحت الفراغ لمدة 24 ساعة وتخزين التشتت في حاوية محكمة الغلق. لبدء التحضير للاختبار ، اخلطي وأتوكلاف 18.12 جراما من أجار R2A ولتر واحد من الماء المقطر.

دع الجل يبرد في درجة حرارة الغرفة. عندما يصبح الجل جاهزا للصب ، ضع 10 مل من الجل في أطباق بتري 90 ملم واترك الأجار يتصلب. في غطاء الدخان ، استخدم حلقة وإبرة معقمة في لهب الكحول لرسم 100 ميكرولتر من خليط أنواع ميثيل البكتيريا على سطح وسط الاستزراع.

احتضن الأطباق على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ، ثم اخلطي 3.12 جرام من مرق R2A مع لتر واحد من الماء المقطر وقم بتعقيم الوسط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. استخدم حلقة وإبرة معقمة لنقل المستعمرات إلى وسط نمو R2A. احتضان العينة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.

قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر كل ساعة حتى تصبح الكثافة الضوئية أكبر من 0.7. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق بتري آخر يحتوي على 10 مل من أجار R2A. ثم اخلطي 3.12 جرام من مرق R2A وثمانية جرامات من أجار مع لتر واحد من الماء المقطر.

قم بتعقيم الخليط على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. امزج 100 ميكرولتر من ثقافة ميثيل البكتيريا في خليط الأجار. صب 10 مل من الجل المحتوي على ميثيل أوبكتيريا فوق الطبقة السفلية من أجار R2A في طبق بتري ، ثم قم بإعداد تشتت التركيز المطلوب من MWCNTs الفضية المجففة بالتجميد في الماء المقطر.

استخدم ماصة دقيقة لتحميل 50 ميكرولترا من هذا التشتت على قرص ورقي معقم ستة ملليمترات في واحد. ضع الماء المقطر على قرص ورق معقم آخر كعنصر تحكم. جفف وتعقيم كلا القرصين في غرفة مفرغة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

ثم ضع عينة MWCNT الفضية والتحكم على الأجار واحتضان لوحة الأجار عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قم بقياس منطقة التثبيط حول عينة MWCNT الفضية عند الانتهاء. قبل الاختبار ، يتم تعقيم الماء المقطر ثلاثي عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بإعداد تشتت 1000 ميكروغرام لكل مليلتر من MWCNTs الوظيفية بحمض الكربوكسيل و 50 ميكروغرام لكل مليلتر ، و 40 ميكروغرام لكل مليلتر ، و 30 ميكروغرام لكل مليلتر من مشتتات MWCNTs الفضية في هذه المياه المعقمة. لبدء إجراء الاختبار المضاد للبكتيريا ، قم بإعداد ثقافة ميثيل البكتيريا كما هو موضح سابقا وراقب كثافتها البصرية عند 600 نانومتر. عندما تكون الكثافة البصرية في الحد الأقصى ، قم بتلقيح 100 ميكرولتر من ثقافة ميثيل البكتيريا في ثلاثة ملليلتر من وسط ثقافة R2A الطازج.

ضع 500 ميكرولتر من هذا المحلول في كل من الأنابيب المخروطية الخمسة سعة 15 مل. أضف 100 ميكرولتر من الميثانول إلى أحد الأنابيب لتحضير العينة المرجعية للميثانول. قم بإعداد عينة لكل من التشتتات الأربعة بنفس الطريقة.

احتضان العينات وثقافة التحكم المتبقية في بكتيريا الميثيل عند 180 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية حتى تشير الكثافة البصرية للتحكم إلى أقصى نشاط. استخدم مفرشة معقمة لنشر كل عينة على جل أجار R2A الصلب في أطباق بتري. احتضن الأطباق على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

عد المستعمرات البكتيرية الناتجة وحدد الحد الأدنى لتركيز مبيد الجراثيم. تم تصنيع MWCNTs الفضية بنجاح باستخدام الإجراء الموصوف. كان متوسط حجم جزيئات الفضة المترسبة حوالي 3.83 نانومتر.

لم يلاحظ نمو ميثيل البكتيريا عند زراعته ب 50 ميكروغرام لكل مليلتر أو 40 ميكروغرام لكل مليلتر مشتت من MWCNTs الفرسانة. تم تقليل عدد البكتيريا 100،000 مرة بالنسبة للعينة الضابطة عند زراعتها بتشتت 30 ميكروغرام لكل مليلتر من MWCNTs الففضية. لوحظت منطقة تثبيط حول عينة محضرة من تشتت 10 ميكروغرام لكل مليلتر من MWCNTs الفرسانية.

لم يلاحظ أي منطقة تثبيط لعينة محضرة من تشتت ميكروغرام واحد لكل مليلتر. لوحظت بعض السمية الخلوية عند إضافة تشتت 40 ميكروغرام لكل مليلتر من MWCNTs الفرسانية. لم يلاحظ أي سمية خلوية كبيرة عند إضافة تشتت 30 ميكروغرام لكل مليلتر.

أكد اختبار التريبان الأزرق أن هناك الحد الأدنى من السمية الخلوية عند إضافة تشتت 30 ميكروغرام لكل مليلتر من MWCNTs الفضية. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين في إعداد المجمعات النانوية التي تحتوي على جزيئات نانوية معدنية تعمل مباشرة على المواد النانوية الكربونية. باتباع هذا البروتوكول ، سيتمكن الباحثون أيضا من تقييم الخصائص المضادة للبكتيريا للمجمعات النانوية المحضرة.