الاستخدام الأمثل "روبوت مناولة السائل" إجراء "عالية الإنتاجية إلى الأمام الكيميائية الوراثة شاشة" التمويل نبات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إجراء فحص علم الوراثة الكيميائية عالي الإنتاجية على شتلات نبات الأرابيدوبسيس. بهذه الطريقة ، يمكننا اكتشاف جزيئات صغيرة جديدة تؤثر على فسيولوجيا النبات بكفاءة وفعالية. ستوفر هذه الاكتشافات الأساس لمزيد من الدراسات في العمليات الفسيولوجية ، مثل تخليق جدار الخلية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن فحص عشرات الآلاف من الجزيئات الصغيرة في فترة زمنية قصيرة. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم للأنواع النباتية النموذجية نبات الأرابيدوبسيس ، إلا أنه يمكن تكييفه بسهولة مع الكائنات الحية الأخرى ، مثل الحشرات أو الكائنات الحية الدقيقة أو زراعة الخلايا. خطرت لنا فكرة هذا البروتوكول لأول مرة عندما علمنا أن مركز الجينوم بالجامعة بحاجة إلى إيجاد منزل لروبوت فائض التعامل مع السوائل.

تطوعنا على الفور لإزالتها من أيديهم. قم بإعداد مكتبة التخفيف ومحددات موضع برامج المختبر الآلي لغسل الأطراف متعددة القنوات أو ALP كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتحميل المعبئ 10s المتصل بدائرة التكديس يدويا.

في الفنادق من A إلى D، قم أولا بتحميل صندوق واحد من أطراف الماصة AP96 P20 في الغرفة الأولى. بعد ذلك ، قم بتحميل أربع ألواح ذات قاع V سعة 96 بئرا في الغرف من الثانية إلى الخامسة مع لوحين علويين يحتويان على تركيزات مخزون من المكتبة المطلوبة واللوحين السفليين الآخرين فارغين. بالإضافة إلى ذلك، قم بتحميل صندوق واحد من أطراف الماصة AP96 P20 في الغرفة السادسة.

قم بتحميل أربع ألواح ذات قاع V سعة 96 بئرا في الغرف من السابع إلى التاسعة مع احتوائان على تركيزات مخزون من المكتبة المطلوبة واللوحين السفليين فارغين. قم بإعداد السطح ب 300 مل من الماء في الخزان على P3 ، وحمام إيثانول سعة 300 مليلتر بنسبة 70٪ على P7 ، و Tip Loader ALP ، و Multi Channel Tip Wash ALP. باستخدام برنامج تشغيل روبوت معالجة السوائل، قدم أطراف ماصة AP96 P20 من وحدة التخزين المؤقت 10 وانقلها إلى Tip Loader ALP.

قم بتقديم الغرفة الثانية من الفندق A وافصل جميع الألواح الأربعة ذات القاع V المكونة من 96 بئرا على سطح السفينة ، مع وضع الطابقين السفليين على P4 و P8 والعلويتين على P5 و P9. قم بتحميل أطراف الماصة AP96 P20 باستخدام اللودر الطرفي ALP على رأس سعة 96 قناة سعة 200 ميكرولتر. استنشق 90 ميكرولترا من خزان المياه سعة 300 مل وقم بتوزيعه في لوحة التخفيف القاع على شكل حرف V المكونة من 96 بئرا على P4. كرر الخطوة للوحة على P8. امزج لوحة المكتبة الكيميائية على P5 عن طريق الشفط المتكرر والصرف عن 15 ميكرولتر ثلاث مرات. بالإضافة إلى ذلك ، قم بسحب 10 ميكرولتر من لوحة المكتبة الكيميائية على P5 وتوزيع 10 ميكرولتر في لوحة التخفيف على P4. امزج محاليل اللوحة على P4 عن طريق الشفط والتوزيع المتكرر 50 ميكرولتر بإجمالي ثلاث مرات.

بمجرد الخلط، قم بتنظيف أطراف الماصة AP96 P20 عن طريق شفط وتوزيع 70 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ من P7، ثم اغسلها في Multichannel Tip Wash ALP عن طريق شفط وتوزيع حجم 110٪ من الماء أربع مرات. كرر هذه الخطوات للزوج الثاني من اللوحات على P8 و P9. عند إنشاء لوحة التخفيف الثانية ذات القاع V المكونة من 96 بئرا ، قم بتكديس الألواح P9 و P5 و P8 و P4 بهذا الترتيب من الأسفل إلى الأعلى. ثم ضع المكدس على ALP ثابت فارغ.

استخدم إما P1 أو P2 أو P6 أو P10 أو P11 أو P12 أو P13. كرر هذه الخطوات حتى تصبح الغرفة الخامسة في الفندق A فارغة، ثم ابدأ العملية مرة أخرى عند الوصول إلى الغرفة السادسة، مع نقل أطراف ماصة AP96 P20 الجديدة إلى اللودر الطرفي ALP ووضع أطراف ماصة AP96 P20 المستخدمة على ALP ثابت فارغ. كرر الإجراء حتى تصبح الغرفة 9 في الفندق A فارغة.

من أجل المتابعة إلى الفندق B ، يجب إعادة تحميل اللوحات والنصائح الموجودة على سطح السفينة في الفندق A.على الرغم من أن الروبوت يمكن أن يعمل دون إشراف ، إلا أنه من الضروري إعادة ملء خزان المياه بعد كل دورة تخفيف. إذا استأنفت الدورة بالماء غير الكافي ، فسيقوم الروبوت بشفط الهواء ولن يتم تخفيف المواد الكيميائية. أعد ملء خزان المياه سعة 300 مل يدويا.

يمكن أن يتضمن برنامج الكمبيوتر وقفة توضح بالتفصيل هذه الرسالة ، مما يتطلب من المستخدم الضغط على متابعة قبل تنفيذ الخطوة التالية. كرر خطوات التخفيف للفنادق الثلاثة المتبقية. أضف البذور يدويا إلى الوسائط بكثافة 0.1 جرام لكل 100 ملليلتر.

ينتج عن هذه الكثافة ما معدله 3-10 بذور لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. ضع يدويا أربعة ألواح ذات قاع مسطح سعة 96 بئرا في الغرفتين الأولى والثانية من الفندق A.ضع صندوقا من أطراف ماصة AP96 P250 على Tip Loader ALP ، وخزان سعة 300 مل مملوء بخليط بذور الوسائط على P3 ، وخزان سعة 300 مل مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول على P7. باستخدام برنامج التشغيل ، قم بتقديم الغرفتين الأولى والثانية في الفندق A وفصل أكوام اللوحات الأربعة. ضع لوحة واحدة على كل من ALPs الثابتة الفارغة، ثم قم بتحميل أطراف الماصة AP96 P250 على رأس 96 قناة سعة 200 ميكرولتر.

استنشق 90 ميكرولترا من خزان بذور الوسائط سعة 300 مل على P3 وقم بتوزيعه في أول صفيحة مسطحة ذات 96 بئرا. كرر هذه العملية حتى تحتوي جميع الأطباق الثمانية على خليط بذور الوسائط. قم بتنظيف أطراف ماصة AP96 P250 عن طريق شفط وتوزيع 70 ميكرولترا من الخزان سعة 300 مل المملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول في P7. اغسل الأطراف في Multichannel Tip Wash ALP عن طريق شفط وتوزيع 110٪ من الماء أربع مرات ، ثم قم بتفريغ الأطراف عند TL1.

أخيرا ، اجمع الأطباق يدويا. قم بتحميل صندوق من أطراف الماصة AP96 P250 يدويا في الغرفة الأولى من الفندق A.أيضا ، قم بتحميل لوحين من مكتبة التخفيف على شكل V سعة 96 بئرا في الغرف الثانية والرابعة والسادسة والثامنة. قم بتحميل لوحين للفحص مسطحة القاع سعة 96 بئرا في الغرف الثالثة والخامسة والسابعة والتاسعة.

باستخدام برنامج التشغيل ، قم بتكوين السطح ليحتوي على خزان غسيل من 300 مل من 70٪ من الإيثانول في P7. يمكن ترك خزان البذور الإعلامية على سطح السفينة في P3. بالإضافة إلى ذلك، قم بتشغيل محرك وحدة التحكم من خلال توصيل وحدة التحكم في الجهاز لتدوير الماء عبر ALP متعدد القنوات. سيتم إيقاف تشغيل هذا تلقائيا في نهاية البروتوكول. قدم صندوق طرف الماصة AP96 P250 من الفندق A وانقله إلى محمل الأطراف ALP.

بعد ذلك ، قدم لوحات مكتبة التخفيف ذات القاع V المكونة من 96 بئرا من الغرفة الثانية من الفندق A إلى سطح السفينة. ضع لوحة واحدة على ALP P4 ثابت ولوحة واحدة على P8. بعد ذلك ، قدم لوحات الفحص المسطحة القاع المكونة من 96 بئرا من الغرفة الثالثة في الفندق A إلى سطح السفينة. ضع لوحة واحدة على ALP P5 ثابت وواحدة على P9. قم بتحميل أطراف الماصة AP96 P250 باستخدام اللودر الطرفي ALP على رأس 96 قناة سعة 200 ميكرولتر.

امزج لوحة التخفيف ذات القاع على شكل حرف V سعة 96 بئرا على P4 عن طريق شفط وتوزيع 50 ميكرولتر ثلاث مرات. بعد ذلك ، استنشق 10 ميكرولتر من هذه اللوحة واستغني عنها في لوحة الغربلة المسطحة القاع المكونة من 96 بئرا على P5. امزج المحاليل في اللوحة عند P5 عن طريق شفط وتوزيع 50 ميكرولتر ثلاث مرات. قم بتنظيف أطراف ماصة AP96 P250 بالإيثانول عن طريق شفط وتوزيع 70 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ من الخزان عند P7. بعد ذلك ، اغسل الأطراف في Multichannel Tip Wash ALP عن طريق شفط وتوزيع حجم 110٪ من الماء أربع مرات.

كرر هذه الخطوات للوحة مكتبة التخفيف السفلية الثانية المكونة من 96 بئرا على شكل حرف V ولوحة الغربلة ذات القاع المسطح 96 بئرا. قم بتكديس لوحي مكتبة التخفيف على شكل حرف V سعة 96 بئرا معا ولوحيتي الغربلة المسطحتين المسطحتين 96 بئرا معا. انقل اللوحات إلى ALPs الثابتة.

بعد ذلك ، كرر العملية ثلاث مرات ، مع إضافة مواد كيميائية مخففة إلى ألواح الغربلة ما مجموعه ثماني مرات. أخيرا ، تحقق من عدد البذور في كل بئر من ألواح الغربلة من خلال التأكيد البصري. استكمل الآبار بأقل من ثلاث بذور عن طريق إضافة البذور المعقمة والبنيوية.

من الأهمية بمكان التأكد من أن الوسائط التي تنمو فيها الشتلات لا تجف ، لأن ذلك سيؤدي إلى ضعف الإنبات. يجب حفظ الألواح التي تحتوي على الشتلات في رطوبة عالية أو تخزينها في حاويات مقاومة للجفاف. احتضان ألواح الغربلة ذات القاع المسطح المكون من 96 بئرا لمدة أربعة أيام في غرفة بيئية عند 22 درجة مئوية في دورة 16/8 ضوء / مظلمة في حاوية مقاومة للجفاف.

تصور ألواح الغربلة ذات القاع المسطح المكون من 96 بئرا تحت مجهر تشريح وسجل جميع الأنماط الظاهرية الشاذة لمزيد من التحقيق. أمثلة على الأنماط الظاهرية الطبيعية والشاذة هي عدم وجود تشوهات مورفولوجية مرئية ، وشعر الجذور البني ، وتقزم الجذر ، والتقزم الشديد في الجذر ، والمبيض ، والصمغ الأخضر ، والإنبات غير المكتمل ، وعدم الإنبات. يتم عرض الأنماط الظاهرية المرئية حسب النسبة المئوية في مخطط دائري.

أظهرت الشتلات تشوهات في مورفولوجيا الجذور والتصبغ وشعر الجذور والإنبات. كما يتم تضمين مجموعة متنوعة من الأنواع الأخرى ، والتي تشمل إنتاج الصمغ الأخضر. بمجرد إتقانها ، يمكن لهذه التقنية أن تزيد بشكل كبير من كفاءة ودقة الشاشات الجينية الكيميائية الكبيرة الأمامية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تعقيم البذور وتبخيرها ، وإعادة ملء خزان المياه أثناء خطوات التخفيف ، والتأكد من تخزين العينات في حاويات مقاومة للجفاف ، وأن جميع الصور تتم في ألواح مسطحة القاع. اعتمادا على العملية الفسيولوجية التي تهتم بالتحقيق فيها ، يمكن متابعة هذه الفحص الأولي بمقايسات إضافية للمساعدة في تحديد طريقة عمل كل مادة كيميائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام روبوت مناولة السوائل لتحسين كفاءة ودقة الشاشة الجينية الكيميائية.