مقايسة ميكرواري البروتين "تحديد المصلية" محددة مستضد "الضد الردود التالية" المطثيّة العسيرة الإصابة

قد تساعد هذه الطريقة في تحسين واختيار العلاجات المناعية المفيدة سريريا لعدوى المطثية العسيرة بطريقة خاصة بالمريض ، وتوضيح الاستجابات المناعية البشرية للكلوستريديوم العسيرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح القياس الكمي الدقيق والمتزامن لاستجابات الأجسام المضادة متعددة النمط والسلالة لمستضدات المطثية العسيرة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الخبرة مطلوبة في إنشاء وتحسين لوحة من المستضدات عالية النقاء ، وإنشاء المنصة التكنولوجية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث تتطلب أنواع القوائم المنهجية المشاركة في إعداد لوحة الميكروويف ، وطباعة المصفوفات ، والإجراء الآمن ، وتحليل البيانات الانتباه إلى التفاصيل. سيتم توضيح بعض الإجراءات من قبل سام غرينوود ، فني من مختبري. للبدء ، قم بتخفيف مستضدات المطثية العسيرة ومخزن الطباعة إلى التركيز الأمثل.

بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولتر من محلول المستضد إلى لوح بئر 384. قم بتغطية اللوحة بختم اللوحة ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. لطباعة المصفوفات الدقيقة ، استخدم موقد غاز محمول باليد لتسخين رقم التعريف الشخصي للسيليكون ثلاث مرات لمدة ثانيتين لكل منهما.

بعد ذلك ، اشطف رقم التعريف الشخصي من السيليكون بالماء النظيف ثلاث مرات لمدة ثلاث ثوان لكل منهما. ضع لوحة المصفوفة الدقيقة في خرطوشة التحميل الخاصة بالمصفوفة. أخرج الدرج، ثم ضع شرائح السيلان الأمينية في درج الشرائح واضغط على الزر موافق لتشغيل المكنسة الكهربائية.

تأكد من تأمين كافة الشرائح، ثم انقر فوق موافق. أعد الدرج إلى الأصل ، وأغلق الغطاء. بعد ذلك ، قم بتشغيل البرنامج المناسب وانتقل إلى ملف ، ثم Microarray Parameters ، ثم افتح. حدد ملف المطثية العسيرة لطباعة جميع المستضدات في أربع مرات.

ضمن هذه النافذة ، افتح علامة التبويب المصدر للإشارة إلى تخزين العينة ، وعلامة التبويب الهدف لإدخال تفاصيل المصفوفة الدقيقة. ثم افتح علامة التبويب "خيارات" لتحديد أداة الغسيل. ضمن علامة التبويب عام في تفضيلات التشغيل، في شريط أدوات مجموعة تطبيقات TAS، حدد غسيل في بداية التشغيل، وغسل في نهاية التشغيل.

افتح علامة التبويب المناخ ، واضبط مستوى الرطوبة بين 55 إلى 60٪ ابدأ الآن التشغيل ، وتحقق بشكل دوري من المصفوفة لضمان الأداء السليم. بعد الطباعة ، ضع الشرائح المطبوعة بعناية في حامل شرائح به 16 غرفة متعددة الآبار. ثم أضف 100 ميكرولتر من 5٪ BSAT إلى كل كتلة.

غطي الشرائح واحتضانها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الرج. استخدم 120 ميكرولترا من PBST لغسل كل كتلة خمس مرات لمدة دقيقة واحدة مع الرج. بعد ذلك ، قم بإذابة عينات المصل التي تم الحصول عليها من المرضى المصابين بالعسيرة C والضوابط الصحية على الجليد لمدة 20 دقيقة.

أضف مخفف الجسم المضاد المتاح تجاريا إلى الكتلة الرئيسية ، ثم أضف عينات إلى الكتلة الرئيسية واخلطها. تخلص من مخزن الغسيل وأضف 100 ميكرولتر من كل عينة مخففة إلى الكتل التجريبية. بالنسبة لكتلة التحكم السلبية ، أضف 100 ميكرولتر من مخفف الجسم المضاد فقط.

ثم احتضن الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. بعد ذلك ، استخدم 120 ميكرولترا من PBST لغسل كل كتلة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق مع الرج. ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للماعز المضاد للإنسان المخفف في مخفف الجسم المضاد لكل كتلة.

غطي الشرائح واحتضنها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. استخدم 120 ميكرولترا من PBST لغسل كل كتلة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق مع رج كل منها. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الستربتافيدين SY5 المترافق المخفف في 5٪ BSAT ، بنسبة واحد إلى ألفين لكل كتلة.

غطي الشرائح بورق الألمنيوم واحتضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف. اغسل الشرائح أولا ب 120 ميكرولترا من PBST خمس مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها ، ثم اغسلها مرتين أخريين لمدة دقيقة واحدة لكل منها باستخدام PBS. لتجفيف الشرائح ، قم بتدويرها لمدة خمس دقائق عند 300 ضعف الجاذبية.

قم بتشغيل الماسح الضوئي بالليزر قبل 30 دقيقة من المسح الضوئي للسماح له بالإحماء. ثم ضع الشريحة في الماسحة الضوئية بحيث يكون السطح المطبوع متجها لأعلى حتى يتحول ضوء اللوحة إلى اللون الأخضر الثابت. بعد ذلك ، اضغط على زر الإعدادات.

في علامة التبويب الأولى، تأكد من إلغاء تحديد التمرير التلقائي والرمز الشريطي. بعد ذلك ، اضبط حجم Pixel على 10 ، ووضع المسح الضوئي على متوسط ، والاكتساب على 635 فقط ، ووضع الاكتساب على يدوي ، والكسب على 20 ، والطاقة على منخفضة. في علامة التبويب الثانية، تأكد من أن نوع الشريحة غير مسمى.

في علامة التبويب الثالثة، قم بتعيين إعداد التركيز البؤري على التركيز البؤري التلقائي. اضغط على زر شبكة الاستيراد لتحديد قائمة الصفيفات المناسبة المقترنة بالصورة الممسوحة ضوئيا. ثم اضغط على زر البحث التلقائي لمحاذاة الشبكة مع البقع الموجودة على الشريحة.

أخيرا ، اضغط على زر عملية القياس الكمي لقياس شدة التألق لكل بقعة. بعد ذلك ، احفظ النتائج بتنسيق مناسب لمزيد من التحليل. في هذا البروتوكول ، تتم مقارنة المصفوفة الدقيقة للبروتين مع ELISA لتقييم قابلية التكاثر بين هاتين التقنيتين.

يظهر تحليل معامل ارتباط سبيرمان اتفاقا كبيرا بين المصفوفة الدقيقة و ELISA للكشف عن مستويات IgG المضادة للسموم A ومضادات السموم B في عينات المصل. يتم حساب مقايسة المقدمة وقابلية التكاثر بين المقايسة للمصفوفة الدقيقة للبروتين باستخدام عينات المصل لسبعة مرضى. تكشف العينات التي تم تحليلها على شريحتين مختلفتين للمصفوفة ضد السم A و Toxin B و SLP001 و SLP002 و SLP027 و Toxin B من Toxin B التي تنتج فقط سلالة CCUG و pCDTb قابلية جيدة للتكاثر.

يتم إجراء مصفوفة دقيقة للبروتين للكشف عن استجابة الأجسام المضادة الخاصة بالنمط الإسوبي ضد سموم المطثية العسيرة. تستخدم عينات مصل المرضى والأفراد الأصحاء للكشف عن مستويات IgG و IgA ضد السم A ، والسموم B ، والسموم B من المطثية العسيرة Toxin B التي تعبر فقط عن السلالة ، وشكل السلائف لجزء B من السم الثنائي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في سبع ساعات.

يجب تقييم تجربة مراقبة الجودة ، والمعلمات المختلفة مثل اختيار كيمياء السطح المناسبة ، ومخازن الطباعة ، والمخازن المؤقتة للحجب ، وتخفيفات عينات المصل والأجسام المضادة الثانوية قبل تشغيل العينات. تتطلب طباعة مصفوفة عالية الجودة فهما جيدا للمصفوفة أو البرنامج لضبط طباعة المعلمات وفقا للبروتوكول التجريبي. من الأهمية بمكان الحفاظ على الأداء الأمثل للمصفوفة ، وبيئة خالية من الغبار طوال التجربة.

ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة والبيولوجيا الجزيئية ، من حيث توصيف الاستجابات المناعية الخلطية للعدوى ، واكتشاف المستضدات التشخيصية المصلية. لا تنس أن التعامل مع عينات الدم المصابة والسموم البكتيرية يمكن أن يكون خطيرا. بشكل عام ، في المختبر ، يجب دائما مراعاة السلامة والاحتياطات القياسية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.