عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

الهدف العام من بروتوكول عزل الخلايا هذا هو الحصول على خلايا بطانية نقية وقابلة للحياة من المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم ، سواء من الورم أو القولون الطبيعي المقابل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الورم وتكوين الأوعية الدموية ، مثل تقدير وتحليل تأثير نظام الأوعية الدموية على تكوين أورام القولون والمستقيم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء أن يكون لديه معدل نجاح مرتفع نسبيا في الحصول على خلايا بطانة بشرية نقية وقابلة للحياة من مرضى سرطان القولون والمستقيم.

للحصول على عينة الأنسجة من مرضى سرطان القولون والمستقيم ، استخدم مشرطا جديدا للحصول على قطع من الأنسجة تزن حوالي جرام. بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما لنقل قطع الأنسجة الطازجة في 40 مل من محلول HBSS المثلج مع المضادات الحيوية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. بعد ذلك ، استخدم ملقطا معقما منفصلا لنقل السرطان والأنسجة الطبيعية بالتتابع من أنبوب طرد مركزي إلى آخر لغسله في 40 مل من محلول HBSS المثلج البارد بالمضادات الحيوية أربع مرات.

لإزالة جميع أجزاء الدهون أو الأنسجة غير السرطانية أو أجزاء الأنسجة النخرية المحتملة ، استخدم ملقطا معقما وانقل قطع الأنسجة إلى طبق بتري لزراعة الخلايا المعقمة. ثم أضف ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت HBSS المكمل بالمضادات الحيوية لترك قطع الأنسجة مبللة. بعد ذلك ، استخدم مشرطا جديدا لتقليم قطع المناديل.

ثم استخدم مشرطا بشفرة منحنية لفرم الأنسجة المتبقية إلى قطع صغيرة. انقل قطع الأنسجة المفرومة إلى أنبوب تفكك الأنسجة المملوء بوسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا. قم بفصل قطع الأنسجة المفرومة باستخدام جهاز فصل الأنسجة ، جنبا إلى جنب مع مجموعة تفكك الورم للأنسجة البشرية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

تتمثل الخطوة الحاسمة الأولى في معالجة عينة الجراحة وتشريحها بشكل صحيح من أجل الحصول على قطع الأنسجة بالحجم الصحيح ونوع الأنسجة. بعد تفكيك قطع الأنسجة ، قم بطردها في درجة حرارة الغرفة عند 300 ضعف الجاذبية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، استخدم ماصة مصلية لإضافة 10 ملليلتر من DMEM Low المتوسط الدافئ مسبقا إلى أنبوب MACS.

بعد ذلك ، اسكب معلق الخلية من الأنبوب على مصفاة خلية بحجم مسام 100 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. ماصة 10 ملليلتر إضافية من DMEM Low medium في أنبوب MACS لطرد الخلايا الإضافية من الأنبوب عبر المصفاة في أنبوب الطرد المركزي. بمجرد تصفية تعليق الخلية بالكامل ، اغسل مصفاة الخلية ب 10 ملليلتر إضافية من DMEM Low Medium.

الطرد المركزي لتعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة عند 300 ضعف الجاذبية لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية بمجرد انتهاء الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بإذابة حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من المضادات الحيوية المكملة ، وسط EBM-2-MV المسخن مسبقا في نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 50 ملليلترا.

قم بإزالة محلول الطلاء من قارورة الثقافة ، وانقل تعليق الخلية مباشرة إلى قارورة ثقافة T-25 يتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما يصل التقاء إلى حوالي 80 إلى 90٪ أضف ملليلتر واحد من Accutase لفصل الخلايا في القارورة. ثم اترك الخلايا مع Accutase لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من وسط EBM-2-MV الذي يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة إلى الخلايا. بعد ذلك ، استخدم جهاز عد الخلايا الآلي بنطاق 10 إلى 25 ميكرومتر لحساب الخلايا. الخطوة الثانية الأكثر أهمية هي جميع الخطوات التي تحتاج فيها الخلايا إلى الانقسام.

تقدير النقطة الزمنية الصحيحة خبرة. إذا كان الانقسام مبكرا جدا ، فسوف تموت الخلايا. إذا فات الانقسام ، فستصل الخلايا البطانية إلى الشيخوخة أو سيكون فرط نمو الخلايا الليفية مشكلة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة عند 250 ضعف الجاذبية لمدة أربع دقائق ، وطرد المادة الطافية في نهاية الجري. بعد ذلك ، قم بإذابة حبيبات الخلية في مخزن مؤقت FACS مسخن مسبقا. ثم أضف الأجسام المضادة لتلوين FACS إلى الخلايا.

تخلط وتحتضن لاحقا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد نصف فترة الحضانة هذه ، قم بنفض الغبار عن الأنبوب مرة واحدة. استخدم ماصة مصلية لإضافة ملليلترين من المخزن المؤقت FACS إلى معلق الخلية المسمى.

بعد ذلك ، قم بعمل الطرد المركزي لتعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة عند 250 ضعف الجاذبية لمدة أربع دقائق ، وصب المادة الطافية بعد انتهاء الطرد المركزي. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت FACS لإذابة حبيبات الخلية ، وقم بالطرد المركزي للتعليق الخلوي في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق عند 250 مرة من الجاذبية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط EBM-2-MV المكملة بالمضادات الحيوية.

بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا إلى أداة فرز FACS. حدد الخلايا الثلاثية الإيجابية ، واتركها تزرع في طبق مزرعة مكون من 24 بئرا مليئا بوسط EBM-2-MV الطازج الدافئ مسبقا. قم بزراعة الخلايا لمدة 48 ساعة ، ثم قم بتجديد الوسط.

استمر في تغيير الوسيط كل يومين حتى يصل الالتقاء إلى 90 إلى 100٪ في خمسة إلى 10 أيام. ثم قم بتوسيع عدد الخلايا وفقا لطبق الثقافة المطلوب. بعد ذلك ، احصد بمجرد الوصول إلى التقاء ، واستمر في التوصيف.

أولا ، يتم فصل عينة الورم التي تم الحصول عليها وزرعها في طبق زراعة الخلايا. يتم غسل الخلايا غير الملتصقة ، ويتم زراعة الخلايا الملتصقة إلى التقاء 80 إلى 90٪ قبل فرز FACS. بعد ذلك ، يتم إجراء تحليل FACS لتحديد سكان الورم القابل للحياة والخلايا البطانية الطبيعية.

للقيام بذلك ، يتم إجراء وضع العلامات الثلاثية الخاصة بالأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم للخلايا البطانية الطبيعية والورم ليتم فرزها من خلال FACS. في المتوسط 3.6 و 5.6٪ من إجمالي الخلايا التي تم فرزها هي الخلايا السرطانية والخلايا البطانية الطبيعية ، على التوالي. بعد ذلك ، لتحديد التعبير عن علامات الخلايا البطانية ، تخضع الخلايا البطانية الطبيعية والورمية التي تم الحصول عليها لكيمياء الخلايا المناعية.

تظهر الصور هنا الخلايا البطانية الطبيعية والورمية الإيجابية CD31. بعد ذلك ، يتم عزل الحمض النووي الريبي من مجموعة الخلايا البطانية الإيجابية CD31 وإخضاعها ل RT-qPCR لتحديد العلامات الأخرى الخاصة بالخلايا البطانية. من الرسم البياني ، تم أيضا الكشف عن علامات الخلايا البطانية ، مثل CD105 و VE-cadherin و von Willebrand ، ولكن لا يوجد تعبير عن علامات من مجموعات الخلايا التي يحتمل أن تكون ملوثة ، مما يشير إلى نقاء مزارع الخلايا البطانية المعزولة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة أسابيع تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب خبرة في مزارع الخلايا البطانية الأولية من أجل تقدير متى وبأي نسب يمكن تقسيم الخلايا أو معالجتها بشكل أكبر لتحليل فرز FACS. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج سرطان القولون والمستقيم لأنه يمكن استخدام مزارع الخلايا لتحديد آليات استجابة علاج تكوين الأورام أو مقاومتها في سرطان القولون والمستقيم.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا تقارير متعددة في الأدبيات تشير إلى مشاكل في إنشاء خلايا بطانية نقية وقابلة للحياة حقا من الأورام البشرية الصلبة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث تتطلب خطوات التشريح الدقيق للأنسجة أو معالجتها لتحليل فرز FACS أو مزيد من الانقسام للخلايا البطانية خبرة من أجل تقدير النقطة الزمنية الصحيحة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أولا إنشاء شبكة تعاونية وظيفية مع الجراحة وعلم الأمراض وسجل الأورام.

علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تدريبك على التمرين للعمل مع مزارع الخلايا البطانية الأولية ، لأن هذه الخلايا هشة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا البطانية عن سرطان القولون والمستقيم البشري والقولون الطبيعي المقابل.