التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)

الهدف العام لهذه التقنية التحليلية هو تحديد كمية عقار الإيثامبوتول المضاد للسل داخل أقسام أنسجة آفة السل لتحديد ما إذا كان يتم الوصول إلى تركيزات الأدوية المضادة للجراثيم. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة في مجال اكتشاف وتطوير أدوية السل من خلال تحديد ما إذا كانت الأدوية المعطاة تصل إلى مجموعات البكتيريا بتركيزات معقمة داخل جميع أقسام أنسجة الورم الحبيبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح القياس الكمي الكامل لتركيزات الدواء بتفاصيل مكانية عالية داخل هياكل أنسجة محددة ومجموعات خلايا.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات تقسيم الأنسجة وتركيبها بسبب احتمالية تلوث الأنسجة والطبيعة الهشة لشرائح الغشاء. ابدأ هذا الإجراء بجمع الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء تقطيع الأنسجة ، اضبط ناظم البرد أولا على درجة حرارة القطع المطلوبة.

انقل خزعة الرئة المشعة بجاما من التخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر إلى ناظم البرد ، واتركه لمدة 30 دقيقة لموازنة درجة حرارة الأنسجة. باستخدام الملقط ، قم بتثبيت الخزعة في ظرف ناظم البرد باستخدام كمية صغيرة من مادة لاصقة درجة حرارة القطع المثلى للصق قاعدة الأنسجة بالظرف قم بتوجيه الأنسجة بحيث يكون السطح المسطح هو السطح المكشوف للقطع.

تأكد من أن OCT لا يلوث سطح الأنسجة ، لأن هذا قد يتداخل مع تحليل قياس الطيف الكتلي اللاحق. قم بقص ثلاثة أقسام من الأنسجة بسمك 25 ميكرون ، وقم بتثبيتها على شرائح غشاء PET. المس الغشاء برفق إلى قسم الأنسجة ، وقم بإزالة القسم.

إذا تم الضغط الشديد ، فقد يتمزق الغشاء الرقيق. تجنب التعامل المفرط مع الشريحة قبل التركيب حتى لا تشحن غشاء PET وتقلل من التصاق قسم الأنسجة. حافظ على انزلاق الغشاء في درجة حرارة الغرفة لتمكين تركيب الذوبان والالتصاق الأنسجة بنجاح بالغشاء.

قم بإزالة الشريحة من ناظم البرد ، واترك الشريحة تجف في الهواء لمدة ثلاث دقائق. إذا لم يتم إجراء LCM-LC-MS/MS على الفور، فقم بإغلاق الشريحة في كيس صغير محكم الغلق ونقله إلى التخزين تحت الصفر 80 درجة مئوية حتى يكون ذلك مطلوبا للتشريح. قم بقص قسم مجاور من 10 إلى 12 ميكرون ، وقم بإذابة الثلج على شريحة زجاجية قياسية لتلوين الهيماتوكسيلين واليوزين.

يمكن قطع أقسام إضافية في هذا الوقت لبقع الكيمياء النسيجية الأخرى المرغوبة. قم بإزالة الكيس المغلق الذي يحتوي على الشريحة من التخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر، واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إذا تعرضت الشريحة الباردة على الفور لجو المختبر ، فسوف تصبح الأنسجة مغطاة بالتكثيف وقد تتعرض السلامة المكانية للدواء للخطر.

قم بتشغيل المجهر والليزر. يتطلب الليزر من خمس إلى 10 دقائق للإحماء قبل أن يبدأ القطع. قم بتحميل أنابيب PCR ذات غطاء مسطح 0.20 مليلتر في الحامل.

بعد إزالة الشريحة من الكيس ، التقط صورة بصرية لقسم المناديل على شريحة PET باستخدام ماسح ضوئي مسطح. ضع الشريحة في حامل الشريحة ، بحيث يكون جانب الأنسجة متجها لأسفل. قم بتعيين أنابيب تجميع منفصلة لمناطق معينة من الورم الحبيبي ذات الأهمية باستخدام برنامج المجهر.

عادة, هذه ستكون الرئة غير المتورطة, الورم الحبيبي الخلوي, والجراب, ولكن قد تختلف اعتمادا على المرض المحدد لخزعة الورم الحبيبي. ركز على الأنسجة باستخدام هدف المجهر 5X. يجب أن يوفر هذا التكبير نظرة عامة جيدة على الأنسجة التي تحتوي على مناطق الورم الحبيبي الخلوي والنخروتي.

في البرنامج ، حدد الأنبوب المعين للجبن لنقله إلى موضعه تحت الأنسجة. أدخل معلمات التشريح المطلوبة. الإعدادات النموذجية لقسم الرئة بسمك 25 ميكرون هي قوة الليزر 30 والسرعة 15 والفتحة 35.

ومع ذلك ، ستختلف هذه اعتمادا على المجهر المستخدم والطاقة المتدنية المحتملة بسبب عمر الليزر. حدد أداة Free Draw ، وباستخدام الماوس أو قلم الشاشة التي تعمل باللمس ، حدد المنطقة المطلوبة للتشريح. سيتم عرض مساحة المنطقة في البرنامج.

احتفظ بمناطق مختارة أقل من 500 ، 000 ميكرون مربع لتسهيل التشريح. كرر التشريح حتى يتم جمع ثلاثة ملايين ميكرون مربع في المجموع في غطاء الأنبوب. في بعض الأحيان ، قد تظل المنطقة التي تم تشريحها عالقة في الغشاء المحيط ولا تقع في غطاء التجميع.

قم بإزالة هذه المناطق من إجمالي مساحة السطح التراكمية عن طريق التحديد والإزالة يدويا داخل البرنامج. بعد ذلك ، حدد غطاء الآفة الخلوية ، واجمع ثلاثة ملايين ميكرون مربع من الأنسجة باستخدام نفس العملية. حدد غطاء الرئة غير المتورطة ، واجمع ثلاثة ملايين ميكرون مربع من الأنسجة باستخدام نفس العملية.

لاحظ أن أنسجة الرئة غير المتورطة تحتوي على العديد من القصيبات والفراغات السنخية. انتبه جيدا لاستبعادها من مناطق الأنسجة المحددة للتشريح. قم بإزالة حامل الغطاء ، وقم بفك كل أنبوب وإغلاقه وتسميه بعناية.

حماية الأنسجة المقطعة من اضطرابات الهواء المحيطة. قم بتحليل الأنسجة المقطعة على الفور ، أو قم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج قبل المعالجة وتحليل LC / MS. بافتراض كثافة الأنسجة تبلغ غراما واحدا لكل مليلتر ، قم بإعداد المخزون المتجانس بوزن 50 ملليغرام من أنسجة التحكم وإضافة المخزن المؤقت PBS للتخفيف.

قم بتجانس الأنسجة عن طريق ضرب الخرزة على أنسجة الرئة ومخزن PBS المؤقت لمدة خمس دقائق عند 1750 دورة في الدقيقة على الخالط الخرزية. بعد ذلك ، قم بتخفيف مليغرام واحد لكل مليلتر من مخزون الأدوية في الأسيتونيتريل / الماء واحد لواحد لإنشاء حلول ارتفاع منحنى قياسية. تحديد التركيزات القياسية المرتفعة بناء على حجم السنبلة وحجم الأنسجة المستهدفة.

المثال المصور هو معيار 100 نانوغرام لكل مليلتر باستخدام حجم سبايك 10 ميكرولتر. قم بإزالة الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة المجهرية من التخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر، واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أضف 10 ميكرولترات من محلول الأسيتونيتريل / الماء واحد إلى واحد وميكرولترين من المخزن المؤقت PBS إلى الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة التشريح المجهري.

بالنسبة للمنحنى القياسي وأنابيب مراقبة الجودة ، أضف 10 ميكرولتر من محلول الارتفاع إلى ميكرولترين من التحكم في الرئة. أضف 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج إلى كل أنبوب. دوامة كل أنبوب لمدة خمس دقائق.

ثم صوتنة لهم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 5 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق لتشكيل حبيبات من الفيلم والأنسجة في كل أنبوب. بعد الطرد المركزي ، انقل 50 ميكرولترا من المادة الطافية إلى صفيحة بئر عميقة سعة 96 بئرا وتخفيفها ب 50 ميكرولترا إضافيا من الماء منزوع الأيونات في كل بئر.

أخيرا ، قم بإجراء تحليل LC-MS / MS والتحقق من صحة الطريقة كما هو موضح في بروتوكول النص. تم التحقق من صحة طريقة LCM-LC / MS لأول مرة عن طريق تحليل المناطق المجهرية بالليزر من الأنسجة المتجانسة بالإيثامبوتول. كما هو موضح هنا ، كانت الطريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وأظهرت تعافيا ممتازا من الدواء.

تم التحقق من صحة تركيزات الإيثامبوتول المقاسة بواسطة LCM-LC / MS في أنسجة الرئة المتعددة من خلال المقارنة المباشرة مع التركيزات التي يحددها نهج LC / MS المعمول به. تم الكشف عن تركيزات مكافئة بواسطة كلتا التقنيتين. تم تحديد تركيزات الإيثامبوتول المطلقة داخل حمة الرئة غير المتورطة ، وحافة الآفة الخلوية ، والجبن النخر بواسطة LCM-LC / MS.

تم الوصول إلى مستويات تعقيم المتفطرة السلية في جميع حجرات الآفات. يشار إلى الحد الأدنى من التركيزات المطلوبة لقتل 99٪ من العصيات المتكاثرة خارج الخلية و 99٪ من العصيات داخل الخلايا في الضامة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح الأنسجة الدقيقة وتحديد مستويات الدواء داخل هياكل الورم الحبيبي الرئوي المحددة.

تمكن هذه التقنية الباحثين في مجال أبحاث الأدوية المضادة للميكروبات من التقييم الدقيق والكمي لما إذا كانت الأدوية التي يتم تناولها تصل إلى مجموعات مسببات الأمراض المستهدفة بتركيزات التعقيم. هذا النهج له قابلية تطبيق واسعة على العديد من الأنسجة المختلفة والحالات المرضية.