العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا العصبية والضامة والخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة اليرقات واستخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة لإجراء تحليل المصب مثل qPCR والنسخ. تعتبر اليرقات المعدلة وراثيا أداة قوية للتصوير الحي وتوفر لنا الفرصة لمراقبة الخلايا الفردية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة في بيئتها المعيشية بمرور الوقت. ومع ذلك ، لاكتساب فهم مفصل لوظائفهم ، نحتاج إلى فهم ملف تعريف التعبير الجيني الخاص بهم ، وقد تم تصميم بروتوكول العزل والفرز الخاص بنا لهذا الغرض.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تعزل أنواعا مختلفة من الخلايا عن الجهاز العصبي المركزي مع الحد الأدنى من التعديل على ملف تعريف التعبير الجيني ، بحيث يمكن توصيف وظائف الخلية وخصائصها. تنعكس كفاءة هذا البروتوكول في فعاليته. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إنتاج كميات كافية من الحمض النووي الريبي في غضون فترات زمنية قصيرة لمختلف التطبيقات النهائية.

بعد تربية أجنة الزرد في وسط E3 الذي يحتوي على PTU وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مجهر مجسم فلوري لفحص اليرقات عند اثنين من dpf للضامة الإيجابية ل GFP والخلايا الدبقية الصغيرة في الخلايا العصبية الإيجابية DsRED. لتجانس الأجنة في وقت واحد خمسة مل من 15 مللي مولار Tricaine لكل 50 مل من المتوسطة إلى 50 اليرقة لتحضير التخدير. ثم استخدم ماصة باستور سعة ثلاثة مل لنقل 10 يرقات في المرة الواحدة إلى طبق بتري سعة 55 مل مملوء بوسط E3 المثلج مع التريكايين لتخديرها بشكل نهائي.

تحت مجهر القصص ، قم بمحاذاة 10 يرقات في وسط طبق بتري ، ثم باستخدام مقص دقيق جراحي ، قم بتمرير رؤوس اليرقات فوق كيس الصفار. باستخدام ماصة باستور سعة ثلاثة مل ، امتلك جميع الرؤوس وبأقل قدر ممكن من السوائل ، انقلها إلى مجانس زجاجي على ثلج يحتوي على مل واحد من الوسائط المثلجة A. استبدل كل طبق بتري صغير يحتوي على E3 المثلج بالإضافة إلى التريكايين بآخر جديد كل 30 دقيقة للتأكد من إجراء التشريح في وسط E3 البارد بالإضافة إلى التريكايين. استبدل الوسائط المثلجة A في الخالط الزجاجي عندما يبدأ اللون في التلاشي.

بمجرد جمع مجموعة الرؤوس بأكملها ، قم بإزالة كل الوسائط A من الخالط الزجاجي واستبدلها بمل واحد من الوسائط المثلجة الطازجة A. مع بقاء الخالط على الجليد ، استخدم مدقة محكمة الغلق لتعطيل أنسجة المخ عن طريق إجراء 40 جولة من التكسير واللفات لثلاث إلى خمس يرقات dpf و 50 طلقة لسبع وثمانية يرقات dpf. ثم أضف ملتين من الوسائط A إلى تعليق الخلية لتخفيف الخلايا وتقليل تكتلانها بالمايلين. تخلص من تكتل الخلايا عن طريق تشغيل معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب صقر بارد سعة 50 مل على الجليد.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. انقل كمية واحدة من معلق الخلية إلى أنابيب باردة بمقدار خمسة مل ، وقم بتدويرها عند 300 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة قياس 23 بوصة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية.

مع مل واحد من وسط التدرج المثلج البارد بنسبة 22 في المائة المتراكب برفق بنقطة صفر خمسة مل من 1X ديسيبل في الثانية المثلج ، أعد تعليق حبيبات الخلية برفق. قم بتدوير الأنابيب عند 950 مرة جم دون انقطاع في التسارع البطيء عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الدوران ، تخلص من وسط تدرج كثافة ديسيبل في الثانية في المايلين المحاصر في الطور البيني.

ثم استخدم صفر نقطة خمسة مل من الوسائط A مع اثنين بالمائة NGS لغسل الخلايا ، وقم بتدوير الأنابيب عند 300 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، ثم اسحب كريات الخلية من نفس الحالة التجريبية معا في مل واحد من الوسائط A مع اثنين بالمائة من NGS. إذا كانت الخلايا ذات الأهمية تعبر عن بروتين فلوري ، فقم بتشغيل تعليق الخلية من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرون ونقلها إلى أنابيب FACS باردة سعة 5 مل على ثلج محمي من الضوء.

لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة المناعية ، استخدم نقطة صفر ثلاثة مل من Medium A بالإضافة إلى اثنين بالمائة NGS لإعادة تعليق حبيبات الخلية ، ثم قسم الخلايا بين ثلاثة أنابيب واحدة وخمسة مل ، واحدة للخلايا غير الملوثة لقياس التألق الذاتي ، وواحدة لقياس الارتباط غير المحدد لجسم مضاد ثانوي بالخلايا الدبقية الصغيرة والثالثة كاختبار. إلى جميع الأنابيب ، أضف واحدا بالمائة من السموم الداخلية المنخفضة الخالية من السموم الداخلية أو ورقة لمنع تفاعلات CD16 و CD32 مع مجال FC للغلوبولين المناعي. ثم احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق مع تحريض لطيف كل خمس دقائق.

بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد 4C4 إلى الأنبوب الثالث واحتضنه لمدة 30 دقيقة مع تحريك لطيف كل 10 دقائق. ثم قم بتدوير الأنابيب عند 300 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام صفر نقطة خمسة مل من الوسائط A بالإضافة إلى اثنين بالمائة من NGS قبل تدوير الأنابيب مرة أخرى.

أعد تعليق حبيبات الخلية بصفر نقطة خمسة مل من الوسائط A بالإضافة إلى اثنين بالمائة NGS ، ثم أضف ورقة واحدة بالمائة واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق مع تحريض لطيف كل خمس دقائق. إلى الأنبوبين الثاني والثالث ، أضف الأجسام المضادة الثانوية وضع الأنابيب في الظلام. بعد تدوير الأنابيب والتخلص من المادة الطافية ، استخدم نقطة صفر خمسة مل من الوسائط A بالإضافة إلى اثنين بالمائة من NGS لغسل العينات مرتين ، ثم أعد تعليق كريات الخلية بمل واحد من Medium A بالإضافة إلى اثنين بالمائة NGS.

قم بتشغيل تعليق الخلية من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرون ونقله إلى أنابيب FACS باردة سعة خمسة مل على الجليد محمي من الضوء. أخيرا ، قم بإجراء فرز FACS واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول النص. في هذه الدراسة ، تم عزل الخلايا العصبية والضامة بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة من ثمانية يرقات إيجابية ل dpf mpeg1 EGFP NBT dsRED.

تم استخدام FACS لفصل الخلايا عن الحطام حسب وظيفة حجمها وحبيبتها. ثم تم فصل الخلايا المفردة عن الزوجيات أو تكتلات الخلايا. من مجموعة الخلية المفردة ، تم رسم بوابة للقضاء على الخلايا الميتة.

كشفت المخطط النقطي المقابل أن هذا البروتوكول التجريبي يحافظ على سلامة غشاء بلازما الخلية حيث أن معدل الخلايا الميتة هو 26.7 في المائة فقط. كما هو موضح هنا ، تم فصل الخلايا العصبية والضامة بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة بسهولة عن بوابات الخلايا الحية. داخل الدماغ ، بدا أن مجموعة الخلايا العصبية أكثر بروزا من البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة.

في دراسة ثانية ، تم استخدام فرز FACS لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الحية من أدمغة اليرقات باستخدام 4C4 ، وهو جسم مضاد يصنف الخلايا الدبقية الصغيرة على وجه التحديد. كما هو موجز في هذا الجدول لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة وبيانات استخراج الحمض النووي الريبي ، يختلف عدد الخلايا الدبقية الصغيرة داخل أدمغة يرقات سمك الزرد ويكون منخفضا جدا عند ثلاثة dpf. أخيرا ، تظهر نتائج استخراج الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من تجربة واحدة من الخلايا الدبقية الصغيرة لخمسة أدمغة من سمك الزرد اليرقات dpf في هذا الأثر الكهربائي مع تصور واضح للحمض النووي الريبي الريبوسومي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 12 ساعة اعتمادا على عدد الرؤوس المطلوبة لكل حالة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على كل شيء باردا والأسطح نظيفة لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب باستخدام أسماك الزرد كنموذج لاستكشاف ملامح التعبير الجيني للخلايا المختلفة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العصبية والضامة والخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة اليرقات الزرد ، وكيفية استخراج الحمض النووي الريبي عالي الجودة لإجراء تحليل المصب مثل qPCR والنسخ.