مسح الشرائح الآلي وتجزئة في الأنسجة المسمى فلوريسسينتلي باستخدام نظام تحليل ويديفيلد عالية-المحتوى

الهدف العام من طريقة التصوير والتحليل هذه هو إنشاء سير عمل سهل الإعداد للتجزئة التلقائية لأي عينة من الأنسجة المثبتة على الشرائح ذات العلامات الفلورية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلوم البيولوجية حول مقدار البروتين المعين الموجود في منطقة معينة من عينة الأنسجة ذات الاهتمام. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن توفير بروتوكولات تحسين الوقت للتجزئة الآلية ، مما يسمح بتطبيق هذه الطريقة على عينات الأنسجة اللاحقة المثبتة على الشرائح ذات العلامات الفلورية.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما احتجنا إلى تحديد خلايا جديدة في أنسجة المخ بتكبير عالي. بعد استيراد اليوميات، افتح مربع الحوار إعداد الحصول على اللوحة، وافتح علامة التبويب الهدف والكاميرا. اضبط التكبير على أربع مرات، وتجميع الكاميرا إلى واحد، والكسب إلى اثنين.

افتح علامة التبويب Plate Slide Scanning وأدخل الإعدادات التجريبية المناسبة. ضمن علامة التبويب المواقع التي يجب زيارتها ، املأ الآبار بشكل موحد بالمواقع وافتح علامة التبويب تحرير إعدادات أسفل اللوحة لإدخال القيم التجريبية المناسبة. بعد حفظ هذه الإعدادات كإعداد A، افتح علامة التبويب الهدف والكاميرا واضبط التكبير على 40 مرة، وتجميع الكاميرا إلى واحد، والكسب إلى اثنين.

تأكد من أن جميع الإعدادات الموجودة ضمن علامتي التبويب Plate Slide Scanning وتحرير Plate Bottom Settings هي نفسها التي تم إدخالها في الإعداد A.وافتح علامة التبويب Acquisition Loop. أدخل عدد الأطوال الموجية الموجودة في العينة وتحقق من خيارات تمكين التركيز البؤري المستند إلى الليزر وتمكين التركيز البؤري المستند إلى الصورة. ثم احفظ هذه الإعدادات كإعداد B.Next، ضع ما يصل إلى ثلاث شرائح ، وقم بتغطية زلة الغطاء لأسفل مع وضع الملصق الموجود على جانب الشق في محول الشريحة.

واضغط على F4 لفتح القائمة الرئيسية. حدد مسح الشرائح وانقر فوق فتح شريحة إخراج الباب لإدخال محول الشرائح في نظام تحليل المحتوى العالي واسع المجال. ثم انقر فوق إغلاق شريحة تحميل الباب.

للبدء ، تأكد من تحديد الطول الموجي المناسب. انتقل إلى مواقع مختلفة داخل الصورة المميزة المباشرة حتى يتم تحديد موقع منطقة الاهتمام. التركيز على المنطقة.

إذا لم يكن في نطاق التركيز البؤري ، فاستخدم زر التركيز البؤري التلقائي ، أو اضبط حجم الخطوة حتى يكون. استخدم المحاذاة لالتقاط الصورة، إذا قمت بضبط التركيز البؤري يدويا عن طريق تغيير حجم الخطوة. لإعداد فحص سابق، قم أولا بتحميل الإعداد A وحدد معاينة الشرائح.

حدد عدد الشرائح وحدد موافق. اختر أربع مرات للتكبير. ثم حدد Coverslip down واستمر في تحديد الإعدادات الأساسية للمسح السابق. تأكد من تحديد كل من إعداد الاكتساب والمعايرة قبل تحديد إلغاء واضغط على متابعة.

ضمن علامة التبويب W1: DAPI ، انقر فوق مباشر ثم التعريض التلقائي ، متبوعا بالمحاذاة. بعد ذلك ، اضغط على إغلاق. حدد الدليل وأدخل اسم المسح الضوئي السابق.

سيظهر مربع الحوار رسم المنطقة تلقائيا. استخدم أداة المنطقة المستطيلة لتحديد منطقة الفحص السابقة بأكملها وانقر فوق متابعة. في نهاية الفحص السابق، قم بتحميل الإعداد B وافتح علامة التبويب المواقع المراد زيارتها.

للبدء ، تأكد من تحديد الطول الموجي المناسب. انتقل إلى مواقع مختلفة داخل الصورة المميزة المباشرة حتى يتم تحديد موقع منطقة الاهتمام. التركيز على المنطقة.

إذا لم يكن في نطاق التركيز البؤري ، فاستخدم زر التركيز البؤري التلقائي ، أو اضبط حجم الخطوة حتى يكون. استخدم المحاذاة لالتقاط الصورة، إذا قمت بضبط التركيز البؤري يدويا عن طريق تغيير حجم الخطوة. بعد ذلك، ضمن علامة التبويب W1 DAPI، انقر فوق التعريض التلقائي وتأكد من أن صورة Plate Acquisitions Snap DAPI واضحة الوضوح.

ضمن القائمة الرئيسية، انقر فوق دفتر اليومية وحدد تشغيل دفتر اليومية في القائمة المنسدلة. انقر نقرا مزدوجا فوق دفتر يومية إعداد اكتساب منطقة الشرائح لبدء التشغيل وانقر فوق متابعة عند ظهور مربع الحوار إعداد اكتساب منطقة الشريحة. عند التعليمات، حدد فحص DAPI لتحديد صورة شريحة التكبير المنخفض وانقر فوق OK. عندما يطلب منك Snap Plate Acquisition Snap، قم بتمييز Plate Acquisition Snap-DAPI وانقر فوق موافق. عند ظهور المربع إنشاء أو تحميل المناطق، استخدم أداة المنطقة المستطيلة لتحديد مناطق الاهتمام في مسح DAPI، وانقر فوق متابعة.

باستخدام أداة محدد المواقع، قم بتمييز منطقة الاهتمام وانقر فوق متابعة، ضمن مربع الحوار تحديد المنطقة. عند ظهور المربع تأكيد المناطق، انقر فوق متابعة وحدد ما إذا كانت المنطقة بحاجة إلى الحفظ عند ظهور مربع الحوار حفظ المناطق. ستظهر ثلاثة مربعات حوار.

انقر فوق متابعة لاستبعاد المربع اكتمال الإعداد. للتخلص من أي عينة من التخمين للعثور على الموقع، تأكد من تحديد عرض الصور أثناء الاستحواذ ضمن علامة التبويب إعدادات العرض وافتح علامة التبويب الملخص للنقر على الحصول على لوحة لتحديد موضع مرحلة منطقة الاهتمام المحددة مسبقا. عندما تتحرك الكاميرا فوق موقع يحتوي على الخلايا ذات الاهتمام، انقر فوق إلغاء لإيقاف الحصول على الصورة.

لا تنزعج إذا كانت الصورة خارج نطاق التركيز. هذه الخطوة هي فقط لوضع مرحلة الموقع الأول في المنطقة التي تحددها الاهتمام. تأكد من أن المرحلة تقع فوق العينة وأنك أدخلت عدد المواقع بشكل صحيح.

قم بتحسين إعدادات الطول الموجي لضمان الحصول على صورة التركيز البؤري في صورة النطاق الديناميكي العالي. ثم افتح علامة التبويب الملخص مرة أخرى، وانقر فوق الحصول على لوحة. في نهاية التحليل، حدد علامة التبويب العرض.

في القائمة المنسدلة تراكب الصور، حدد إظهار معلومات البئر لعرض أرقام المواقع في الزاوية العلوية اليسرى. قم بالتمرير عبر المواقع واستبعد أي مواقع خارج نطاق التركيز و / أو تحتوي على طيات الأنسجة أو الفقاعات والتمزقات في الأنسجة. في هذه الصورة التمثيلية، يتم عرض صور مصغرة عالية التكبير لجميع المواقع داخل منطقة الاهتمام المحددة.

يجب مراجعة كل موقع لتحديد المواقع التي يجب استبعادها من التحليل. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، كان الموقع 149 خارج التركيز ، والموقع 219 يحتوي على فقاعات ، والموقع 54 يحتوي على طية. تم استبعاد جميع هذه المواقع الثلاثة من التحليل.

هنا ، توضح التراكبات المقابلة التي تم إنشاؤها بواسطة وحدة تسجيل الخلايا متعددة الأطوال الموجية نتائج التجزئة الآلية التي تم إجراؤها في الموقع 59 كما تم تخصيصها وفقا للمواصفات التجريبية. بعد التجزئة ، يمكن الحصول على البيانات الكمية لنسبة الخلايا الملطخة لكل علامة ، ويمكن الحصول على كل من العلامات ، وعدم وجود علامات ، ومتوسط المساحة الملطخة ، ومتوسط شدة الفلورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نظام تحليل المحتوى العالي واسع المجال لإنشاء سير عمل آلي لتصوير وتجزئة عينة الأنسجة المثبتة على الشريحة.