تحديد مستقبلات الدوبامين D1-ألفا داخل Accumbens نواة القوارض بالحمض النووي الريبي مبتكرة في الموقع تكنولوجيا الكشف عن

الهدف العام من مقايسة التهجين الجديد للحمض النووي الريبي في الموقع هو تصور جزيئات الحمض النووي الريبي المفردة في منطقة معينة من الدماغ والتي تعتبر ضرورية لتوضيح الخلل الوظيفي الدوبامين أثناء مرض الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل تشوهات الدوبامين التي تتوسط الاستجابات السلوكية وتعديل وظيفة الذاكرة العاملة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها توفر تقنية تهجين جديدة في الموقع للتحقيق في خلل نظام الدوبامين أثناء تطور أمراض الجهاز العصبي المركزي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمستويات التعبير الإجمالية للرنا المرسال المستهدف في منطقة معينة من الدماغ ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا لتحديد كيفية توزيع نصوص الرنا المرسال عبر خلايا منطقة معينة. لبدء هذا الإجراء ، في غضون خمس دقائق بعد حصاد دماغ فأر بالغ ، اغمره في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، قم بتوازن الدماغ عند 20 درجة مئوية تحت الصفر في ناظم البرد لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة ، قم بقطع 30 ميكرون تحتوي على نواة متكئة من 2.76 ملم إلى 2.28 ملم أمام بريجما وقم بتثبيتها على الشرائح. ثم جفف الأقسام عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في 4٪ بارافورمالدهيد المبرد مسبقا لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، ضع الشرائح في تدرج متزايد من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة ثم انقل الشرائح إلى الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ لمدة خمس دقائق أخرى. بعد ذلك ، ضع الشرائح على الورق الماص للسماح بالجفاف في الهواء. ارسم حاجزا حول كل قسم بقلم حاجز.

دع الحاجز يجف تماما لمدة دقيقة واحدة. لمعالجة أقسام الدماغ مسبقا ، قم بتشغيل الفرن واضبط درجة الحرارة على 40 درجة مئوية. أضف ثلاث قطرات من كاشف ما قبل العلاج على كل قسم من أقسام الدماغ.

ثم احتضان الأقسام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في 1X PBS لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وانقل الشرائح إلى 1X PBS جديد لمدة دقيقة أخرى. يجب ألا تبقى الشرائح في 1X PBS لمدة تزيد عن 15 دقيقة.

لتشغيل مقايسة تعدد الإرسال ، قم بتسخين المسبار المستهدف لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية في حمام مائي ثم قم بتبريده إلى درجة حرارة الغرفة. ضع كاشف الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح بورق ماص وضعه مرة أخرى على رف الشرائح.

ثم أضف ثلاث قطرات من Drd1alpha كمسبار على كل شريحة عينة واحتضان العينات لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في مخزن غسيل 1X لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مرتين. ثم قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح بورق ماص وضعه مرة أخرى على رف الشرائح.

لا تدع أقسام الدماغ تجف بين خطوات الحضانة. أضف ثلاث قطرات من AMP 1FL على كل شريحة عينة واحتضن العينات لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين في مخزن غسيل 1X لمدة دقيقتين في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح بورق ماص وضعه مرة أخرى على رف الشرائح. بعد ذلك ، أضف ثلاث قطرات من AMP 2FL على كل شريحة عينة. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغمر الشرائح في مخزن غسيل 1X لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مرتين. قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح بورق ماص وضعه مرة أخرى على رف الشرائح. أضف ثلاث قطرات من AMP 3FL على كل شريحة عينة واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح في محلول غسيل 1X لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مرتين. قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح بورق ماص وضعه مرة أخرى على رف الشرائح. ثم أضف ثلاث قطرات من AMP 4FL ALT A على كل شريحة عينة واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.

اغسل الشريحة في مخزن غسيل 1X لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مرتين. قم بإزالة السائل الزائد من الشرائح وضع قطرتين من كاشف التثبيت على الفور على كل قسم. بعد ذلك ، ضع غطاء 22 ملم × 22 ملم فوق كل قسم من أقسام الدماغ.

ثم قم بتخزين الشرائح في الظلام عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية حتى تجف. للتصوير ، قم بتشغيل المجهر متحد البؤر والتبديل إلى هدف 60X. احصل على صور مكدس Z واحصل على صور للخلايا المسماة Drd1alpha في منطقة النواة المتكئة.

بالنسبة للصور من النواة المتكئة التي عرضت نمط تلطيخ النقاط المنفصلة ، تم تقييم النطاق الديناميكي للتعبير باستخدام تحليل شبه كمي. تم تسجيل كل خلية من صفر إلى تسعة بناء على عدد النقاط لكل خلية. وبالتالي يمكن لطريقة درجة الإشارة المهجنة هذه تقييم مدى وتباين تعبير Drd1alpha عبر الخلايا الفردية.

فيما يلي الصور التمثيلية متحدة البؤر لتعبير Drd1alpha في ذكور وإناث الفئران التي لها نمط تلطيخ النقاط المنفصلة. لحساب بنية البيانات المتداخلة ، تم حساب متوسط قيم العد لكل فئة واستخدامها للتحليل الإحصائي. تم إجراء اختبار Mann-Whitney U لتقييم الاختلافات في متوسط عدد الخلايا في ذكور وإناث الفئران.

يتم تحليل تواتر الخلايا في كل فئة باستخدام التردد النسبي والتردد التراكمي. أظهرت إناث تحولا كبيرا في التوزيع مع زيادة وتيرة الخلايا في الفئات ذات الترتيب الأدنى مقارنة بذكور. بشكل عام ، تشير النتائج إلى اختلافات واضحة بين الجنسين في تعبير Drd1alpha في النواة المتكئة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة لأن تغيرات درجة الحرارة أو جفاف الأنسجة يمكن أن يتلف mRNA ويعيق قدرتنا على الحصول على إشارة موثوقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تقنية التهجين في الموقع في الأنسجة القشرية ، ونصوص mRNA لإشارة الصورة الفلورية داخل مناطق الدماغ المختارة ، وتوصيف توزيع نصوص mRNA للتحليل الإحصائي.