تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية

الهدف العام من هذه المنهجية هو توفير إجراء موحد للحصول على صور لشرايين المقاومة البشرية الحية لتحليل العلاقة بين الهندسة المعمارية الدقيقة للمصفوفة خارج الخلية وميكانيكا جدار الشرايين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الأوعية الدموية وميكانيكا مثل كيفية إحداث الضغط تغييرات في الهندسة الكلية بالإضافة إلى الهندسة الدقيقة لجدار الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنك لست مضطرا إلى تسمية عينتك للتصوير.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لميكانيكا الشريان المقاوم ، إلا أنه يمكن تطبيق نسخة معدلة من البروتوكول على أعضاء أخرى شبيهة بالأنبوب مثل الشعب الهوائية أو على شرائط من المثانة البشرية أو جدار الأمعاء. للبدء ، قم بجمع عينات الأنسجة ذات الأهمية فور استئصالها أثناء الجراحة وقم بإعداد الأوعية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ضغط الشريان المقنن إلى خمسة ملليمترات من الزئبق.

ثم قم بإعداد المسار البصري للتصوير عن طريق تنشيط ليزر ثنائي الفوتون وضبط الطول الموجي للإثارة على 820 نانومتر. أدخل مرآة ثنائية اللون بطول 460 نانومتر لتقسيم ضوء الانبعاث بين مضاعفات الصور وتجميع الانبعاث في وقت واحد في قناتين. استخدم مرشحات ممر النطاق بعرض 30 إلى 60 نانومتر متمركزة عند 520 نانومتر لجمع التألق الذاتي للإيلاستين وأخرى متمركزة عند 410 نانومتر لجمع إشارة التوليد التوافقي الثاني للكولاجين.

الآن اضبط وقت سكون الليزر والبكسل على 10 ميكروثانية. اضبط الدقة على 512 × 512 بكسل لمجال رؤية 100٪. قم بتمكين المسح المستمر واستخدم أقل قدر ممكن من طاقة ضوء الإثارة ووقت سكون البكسل لتجنب إتلاف الصورة للشريان الحي.

ثم امسح الشريان يدويا للعثور على المستوى بأقصى قطر. بعد ذلك ، اختر شريحة مستطيلة تغطي أوسع قطر للشريان وامسح إطارا واحدا بحجم بكسل 300 نانومتر لكل بكسل أو أقل. احفظ هذه الصورة للتحليل في وقت لاحق.

لتحديد قطر التجويف وسمك الجدار عند الحد الأقصى لقطر الشريان ، قم أولا بتحميل الصورة في فيجي. اضبط المقياس بالنقر فوق القائمة الرئيسية ثم انتقل إلى التحليل متبوعا بتعيين المقياس. هنا أدخل الميكرومتر لكل بكسل ونسبة البكسل.

بعد ذلك ، اختر أداة خط فيجي وارسم خطا بين الصفيحتين المرنتين الداخليتين على كل جانب من تجويف الشريان. ثم انقر فوق Control M للإبلاغ عن الطول في جدول النتائج. استمر في رسم المزيد من الخطوط لقياس سمك كل جدار وحفظ القياس النهائي.

قم بالتغيير إلى هدف 60X بفتحة عددية واحدة أو أكثر. قم بتصوير العمارة الدقيقة للكولاجين والإيلاستين عند خمسة ملليمترات من الزئبق عن طريق مسح سمك جدار الشرايين بالكامل. بعد ذلك، حدد عمق البداية والنهاية لمكدس Z وتباعد الخطوات Z وكثافة البكسل.

عندما تقوم بتصميم مكدسات Z الخاصة بك ، تأكد من أن منطقة اهتمامك صغيرة بما يكفي لتجنب أي استدلال على الانحناء في تحليلك اللاحق. عند الانتهاء، اضبط كل قناة ليتم حفظها على حدة. أخيرا ، ابحث عن منطقة واحدة إلى ثلاث مناطق مختلفة ذات أهمية واحصل على مجموعات صور ثلاثية الأبعاد ذات نوعية جيدة.

إذا كان التألق الذاتي للإيلاستين الخاص بك مبيضا ، فأنت تستخدم طاقة ضوئية عالية جدا للإثارة. يجب تجنب ذلك. لإنهاء تجربتك الجارية ، يمكنك إضافة تركيز مخفف من اليوزين لتعزيز التألق الذاتي للإيلاستين.

عند الانتهاء ، كرر العملية بأكملها بضغوط تتراوح حتى 100 ملم زئبق ، واستبدل المخزن المؤقت في غرفة التصوير العضلي ب 37 درجة مئوية HBS طازجة بعد كل خطوة ضغط. لبدء تحليل الصور ، افتح مكدس صور الإيلاستين في فيجي. ثم انتقل إلى الصورة ، وانقر فوق المكدسات ، وحدد مشروع Z لاختيار الصور للعمل معها واختيار أقصى كثافة لنوع الإسقاط.

احفظ الإسقاط الأقصى للكثافة كصورة TIFF. ثم اختر أكبر عدد ممكن من نقاط تفرع ألياف الصفيحة المرنة الداخلية وقم بقياسها باستخدام أداة الزاوية. اعمل بشكل منهجي من خلال كل صورة وعند الانتهاء ، احفظ ورقة نتائج فيجي.

لقياس تموج الكولاجين العرضي ، افتح كومة صور الكولاجين في فيجي. بعد ذلك ، انتقل إلى الصورة لأسفل إلى المكدسات وحدد مشروع Z لاختيار الصور للعمل معها وتعيين الإسقاط الأقصى للكثافة. الآن قم بتغيير نوع الصورة إلى صورة TIFF بثمانية بت بالنقر فوق الصورة والنوع ثم ثماني بتات.

احفظ الإسقاط الأقصى للكثافة كصورة TIFF. افتح المكون الإضافي Neuron J بالنقر فوق Fiji وتحديد Neuron J ضمن المكونات الإضافية. ثم افتح ملف TIFF ثماني بت في Neuron J.بمجرد فتحه ، انقر فوق إضافة تتبع وحدد الألياف لتحليلها بالنقر فوق بداية ونهاية كل ليف.

بعد ذلك ، انتقل إلى قياس التتبع واختر تتبع العرض وقياسات الرأس في مربع الحوار. لحساب استقامة ألياف الكولاج ، انسخ القيم الموجودة في نافذة تتبع فيجي أولا إلى Excel. قيم الطول في نافذة التتبع هي مقاييس للأطوال الكاملة لألياف الكولاجين التي تم تحليلها Lf.Second ، قم بتحليل إحداثيات XY الأولى والأخيرة لنافذة رؤوس فيجي إلى Excel.

ثم احسب طول الخط المستقيم الذي يربط كل طرف من طرفي ألياف الكولاجين التي تم تحليلها L0 باستخدام نظرية فيثاغورس. يتم حساب استقامة ألياف الكولاجين أخيرا على أنها L0 / Lf. باتباع البروتوكول الموضح للتو ، تم تحديد أوسع جزء من الشريان وفي هذه المرحلة تم فحص الشريان باستخدام الفحص المجهري الفلوري الخالي من الملصقات لقياس الحد الأقصى لقطر الوعاء وسمك جدار الوعاء الدموي.

باستخدام تكبير أعلى لهدف الفتحة العددية العالية ، لا يمكن قياس قطر الوعاء وسماكة الجدار فحسب ، بل يمكن أيضا قياس البنى الدقيقة للكولاجين والإيلاستين. يمكن تحديد البنى الدقيقة لزوايا تفرع ألياف الإيلاستين واستقامة الكولاجين في أقسام الصور المتتالية باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب. يسمح هذا بإجراء تحليل مباشر للعلاقة بين التغيرات الناجمة عن الضغط في البنى الدقيقة للكولاجين والإيلاستين ومعامل المرونة المتزايد عند ضغوط مختلفة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخراج معلومات أخرى من الصور أيضا. يمكن أن يكون هذا هو الملائكة التوجيهية للكولاجين العرضي على طول المحور الطولي للوعاء الدموي أو يمكن أن يكون الهندسة المعمارية الدقيقة للمصفوفة خارج الخلية في وسط الغلالة. يمكن إدخال المقاييس الكمية المستخرجة من الصور باستخدام هذه الطريقة في نماذج رياضية من أجل توضيح كيفية استجابة الدورة الدموية البشرية السليمة والمتوفة للظروف المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم شامل لكيفية تصميم تجارب التصوير الخاصة بك وتحليل الصور اللاحق من أجل استخراج معلومات حول كيفية إحداث الضغط للتغييرات في البنية الدقيقة لجدار الشريان المقاومة. تذكر أنه يجب عليك تجنب أي تعرض للضوء المرئي وغير المرئي عند العمل باستخدام الفحص المجهري الفلوري للإثارة ثنائي الفوتون.