إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

يمكن أن تساعد هذه الرسالة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في النماذج المناعية في النماذج مورين، مثل العلامات المستخدمة لتحديد أنساب مناعة مختلفة واستراتيجيات الشيخوخة. الفائدة الرئيسية لهذه التقنية هو أن علامة و stategies الشيخوخة، عندما immunoenotyping، يمكن أن تنطبق على مجموعة متنوعة من نماذج مورين. مراقبة وزن الجسم من C57 الأسود 6 الفئران باستخدام التوازن.

أيضا، رصد حجم الورم من الفئران المانحة متفاوتة الورم حسب قياس العيار. بعد القتل الرحيم من الحيوان في غطاء محرك السيارة الخطر الحيوي وفقا للبروتوكول، تعقيم الجلد حول الورم باستخدام مسحات يودوفور. بعد إزالة الورم الجراحي كما هو مفصل في بروتوكول النص ، ضع الورم في طبق بتري يحتوي على 20 ملليلتر من PBS الذي تم تبريده مسبقًا إلى 4 درجات مئوية.

إذا كان هناك تلوث الدم، ونقل الورم إلى طبق بيتري آخر وغسل الورم مع برنامج تلفزيوني. قطع الورم إلى نصفين. إزالة أي الجلد اضافية، والأوعية، والتكلس، ونخر.

اختيار قطعة سليمة فقط من الورم ووضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر معقمة. أضف 20 ملليلتر من PBS قبل نقل أنبوب إلى غرفة حيوانية منفصلة لدراسات علم الصيدلة. للتحضير لزراعة العظام، قم بإصلاح ماوس تخدير كامل على لوحة تجارب في الوضع الجانبي الأيمن.

تطهير الجلد حول الطحال مع اليود ومن ثم دي iodinate مع 75٪ من الكحول الإيثيل. العثور على نقطة وسيطة من الطحال وجعل شق عمودي 1 سنتيمتر على البطن لفضح الطحال. بلطف، ارسم جزءًا من أنسجة البنكرياس تحت الطحال باستخدام ملاقط طرف مسطح.

وsutro الماوس قطعة ورم هوموجرافت من الماوس C على البنكرياس من الماوس المتلقي من قبل خياطة الجراحية 9-O bsorbable. أغلق البطن بخياطة حريرية من 6 إلى 6 O بواسطة خط التماس المزدوج. تحقيق التوازن عن طريق الضغط.

بعد الانتهاء من زرع الورم، والحفاظ على الحيوان في قفص دافئ طالما لا يحدث أي نزيف أو تسرب أنسجة الورم. مراقبة الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على إعادة شغل القص. إعادة الحيوان إلى غرفة الحيوان بعد الشفاء التام من التخدير.

مراقبة الورم الفئران متفاوتة عن طريق تجا ة البطن بالقرب من الطحال واختيار الفئران التي تحمل أورام العظام. لكل ورم، إعداد أنبوب C واحد مع العازلة هضم الورم. استخدام 3 ملليلتر من عازلة الهضم لشظايا الورم أقل من 0.8 غرام لضمان هضم الورم تماما.

تسمية الورم مع رمز الدراسة, ورم, معرف الماوس, مجموعة العلاج, ووصم الورم. جمع الورم من الماوس. اغسل الورم في برنامج تلفزيوني بارد وانظف الأنسجة التي تعلق على الورم.

وضع الورم في وسائل الإعلام الهضم في بئر واحد من لوحة 6-جيدا عقيمة. عقد الورم في مكان مع ملاقط معقمة أو ملقط وشريحة مع مشرط. شريحة الورم جيدا بما فيه الكفاية لكسر إلى قطع أصغر.

الآن، ضع قطع الورم مرة أخرى في أنبوب C واستخدم المخزن المؤقت المتبقي للهضم لغسل الطبق. نقل السائل في أنبوب سي ووضعها على الجليد حتى الهضم. ثم التبديل على الفصام مع سخانات.

وضع الورم تفكك C-أنبوب رأسا على عقب في كم من المنصب الشاغر. ضبط حالة وضع الأنبوب من حر إلى محدد. اختيار برنامج فصل متبوعاً بتحديد المجلد المطلوب حيث يتم عرض قائمة البرنامج.

بعد إنهاء البرنامج، واتخاذ جيم أنبوب قبالة الفصام وتدور لفترة وجيزة إلى البليت العينة. الآن، إعادة تعليق العينات ووضعها في مصفاة الخلية فوق أنبوب 50 ملليلتر. اغسل الخلية من خلال مصفاة الخلايا بـ 10 ملليلتر من مخزن الغسيل لتوفير تعليق خلية واحدة.

بعد أنبوب الطرد المركزي في 300 G لمدة 5 دقائق، والتخلص من عظمى وإعادة تعليق الخلايا مع 5 ملليلتر من العازلة الغسيل. عد الخلايا القابلة للحياة وضبط تركيز الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل أنبوب أو لكل عينة. تنفيذ تصميم لوحة مناعية، والمناعة وفلوريسنس ناقص عنصر تحكم واحد كتفاصيل في بروتوكول النص.

إعداد الخرز UltraComp في حين أن أدوات تدفق الاحماء من قبل دوامة لهم جيدا قبل الاستخدام. تسمية منفصلة 12 × 75 ملليمتر عينة أنبوب لكل فلوروتشرومات الأجسام المضادة مترافق. إضافة 100 ميكرولتر من البقع العازلة إلى كل أنبوب تليها قطرة واحدة كاملة من الخرز.

إضافة الأجسام المضادة وتنفيذ الإجراء تلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم إضافة 0.5 ملليلتر من مخزن البقع إلى كل بيليه حبة وإعادة تعليق تماما عبر دوامة. الآن، تعيين تدفق الجهد PMT قياس الانبعاثات في الأنسجة المستهدفة للتجربة معينة.

تشغيل العينة من خلال عينة من خلال عملية استئصال التدفق من أجل الحصول على البيانات من خلال كسب على السكان حبة المفرد في مبعثر إلى الأمام و الجانب قراءات مبعثر. تعيين معدل التدفق حول 200 إلى 300 الأحداث في الثانية الواحدة. تعيين التعويض المناسب للأجسام المضادة الاقتران الفلوريسين فيتC معين باستخدام مؤامرة FL1 مقابل FL1 نقطة.

ضع بوابة رباعية بحيث تكون الخرزات السلبية داخل الربع السفلي الأيسر والخرز الإيجابي داخل الربع الأيمن العلوي أو السفلي. ضبط قيم التعويض حتى تكون كثافة الفلورسين المتوسط لكل مجموعة متساوية تقريباً. كرر هذه الخطوات لجميع الأنابيب.

الآن، المضي قدما في الحصول على عينات البقع الفعلية. قم بتشغيل معالج التعويض واحفظ الإعداد بالتنسيق: التاريخ والتجربة والأحرف الأولى. أدى زرع العظام من غدية القناة البنكرياسية في نمو الورم السريع مماثلة لتلك التي شوهدت في زرع تحت الجلد.

يتم عرض صور التلطيخ التمثيلية للهماتيوكسيلين واليوسين وإظهار نمو مماثل للزراعة تحت الجلد والعظام. تم الحصول على غلة خلايا قابلة للحياة عالية بشكل معقول من عينة الورم من كلا النوعين من الزرع. يظهر splat ممثل FACS خلايا قابلة للحياة من الورم المنفصل عن الخلايا الميتة ومخلفات الخلايا.

يظهر هنا، هو ورم يتسلل إلى مقارنة ملف المناعة بين مجموعات الخلايا الرئيسية والبسطية للعديد من المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا المناعية للورم. يتم عرض تحت الجلد مقابل homograft تقويم العظام من سرطان البنكرياس. البيانات تظهر بوضوح أن الورم قد يزيد بشكل كبير من تسرب الخلايا المناعية بالمقارنة مع البنكرياس من الفئران السليمة.

بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على نسب مئوية مختلفة من الورم الذي يتسلل إلى مجموعات فرعية من الخلايا المناعية في التوامُع العظمي مقابل التواهم تحت الجلد. على سبيل المثال، هناك خلايا B في تقويم العظام أكثر بكثير من الخلايا تحت الجلد. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر لإعداد جميع المواد والكواشف المرتبطة بها مقدما.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل FACS لنماذج مورين.