الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي وموت الخلايا بيروبتوتيك في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام

تتمثل الأهداف العامة لهذا البروتوكول في فحص تنشيط الالتهاب على مستوى الخلية المفردة عبر المجهر الفلوري وقياس التحلل أثناء داء الحمى بواسطة نازعة هيدروجين اللاكتات ، أو مقايسة إطلاق LDH. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهابات ، مثل كيفية تنظيم تنشيط Caspase-1. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تسمح للمستخدم بفحص خطوات متعددة لتنشيط الالتهابات ومسارات داء الحمى

سيوضح الإجراء أندرياس دن هارتيغ ، عالم أبحاث من مختبري. ابدأ باستبدال الوسط من البلاعم المشتقة من نخاع العظم LPS المزروعة على أغطية زجاجية ب 290 ميكرولتر من وسط DMEM 5 ، مكملة بخمسة ميكرومولار نيجيريسين وخمسة مللي مولار جلايسين ، لكل بئر. أعد الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، مع إضافة 10 ميكرولتر من 30X FAM-YVAD-FMK بعد أول 15 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من PBS البارد لكل بئر ، ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة وقم بإصلاح الخلايا ب 250 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد لكل بئر لمدة 30 دقيقة على ثلج محمي من الضوء ، مع وضع العلامات على الخلايا بصبغة نووية مضان مناسبة خلال الدقائق الخمس الماضية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS البارد كما هو موضح للتو وقم بتحميل كل شريحة بسبعة ميكرولترات من وسط التثبيت المضاد للبهتان. ضع غطاء على كل شريحة واترك وسط التثبيت يتماسك طوال الليل قبل إغلاق الغطاء بطلاء الأظافر.

لتصوير الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري ، ضع شريحة التحكم غير المعالجة على مرحلة المجهر وركز يدويا على الخلايا. باستخدام إعدادات جدول البحث المجهري ، اضبط الإزاحة حتى لا يلاحظ أي تلطيخ إيجابي للمسبار في الخلايا غير المعالجة. بعد ذلك ، باستخدام عينة معالجة من النيجيريسين ، حدد موقع الحقل الذي يحتوي على خلايا إيجابية وسالبة على حد سواء لتلوين المسبار واضبط مستوى التصوير لقناة المسبار على المستوى الذي يحتوي على أعلى شدة من التلوين الإيجابي.

ثم اضبط الكسب حتى تظهر البؤر في الخلايا ذات النوى المكثفة واحصل على صور لخمسة حقول مختارة عشوائيا لكل شريحة بتكبير إجمالي 100X. للتحليل الكيميائي المناعي للخلايا المعالجة بالنيجيريسين ، اغسل الخلايا المسماة بالدعامة كما هو موضح للتو واحتضان الخلايا في 250 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية لكل بئر لمدة 30 دقيقة على الجليد ، محمي من الضوء. اغسل البلاعم ثلاث مرات أخرى باستخدام محلول غسيل طازج وقم بتسمية الخلايا ب 250 ميكرولترا من الجسم المضاد الأولي ضد بروتين يشبه البقعة المرتبط بتدلي الجفون يحتوي على مجال تجنيد كاسباز C ، أو ASC ، لكل بئر ، لمدة ساعة واحدة على الجليد.

اغسل الخلايا في نهاية الحضانة وقم بتسمية العينات ب 250 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي المترافق بصبغة التألق المناسبة لمدة ساعة أخرى على الجليد ، مع إضافة أربعة ميكرولترات من صبغة تلطيخ نووية مضان مناسبة خلال الدقائق الخمس الماضية. بعد غسل الخلايا ثلاث مرات في مخزن مؤقت للغسيل البارد ، قم بتركيب أغطية على الشرائح بسبعة ميكرولترات من وسط التثبيت المضاد للبهتان ، كما هو موضح ، وقم بتصوير البلاعم عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري. لإجراء اختبار إطلاق LDH ، أضف 50 ميكرولترا من وسط DMEM 5 مكملا ب 10 ميكرومولار نيجيريسين لكل بئر تجريبي و 50 ميكرولترا من DMEM 5 إلى آبار التحكم التلقائي و 100٪ للتحكم في التحلل لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 30 دقيقة ، أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحلل 10X إلى آبار التحكم في التحلل بنسبة 100٪ وأضف 10 ميكرولتر من الوسط إلى الآبار الأخرى. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة ونقل 50 ميكرولترا من المادة الطافية من كل بئر إلى صفيحة شفافة ذات قاع مسطح. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الركيزة المذابة والمعدة حديثا إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في الظلام ، وتحقق من اللوحة بعد 15 دقيقة للتأكد من أن الإشارة لن تتجاوز حد الكشف عن قارئ اللوحة.

في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من محلول التوقف لكل بئر وقم بقياس OD490 على قارئ لوحة مناسب للسماح بحساب النسبة المئوية لتحلل الخلية لكل بئر. بينما تظهر البلاعم المعرضة للنيجيريسين تكوين تركيز ASC في المنطقة المحيطة بالنووية التي تحتوي أيضا على Caspase-1 النشط ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تخضع لداء الحمى الحراري. في حين أن البلاعم من الفئران التي تعاني من نقص Caspase-111 تولد أيضا تركيزا على ASC ، فإن هذه الخلايا لا تحتوي على أي Caspase-1 نشط مرتبط بهذا التركيز ، كما يتضح من عدم وجود تلطيخ FAM-YVAD-FMK.

كما أن نوى هذه الخلايا غير مكثفة ، مما يشير إلى عدم وجود موت الخلايا الحمى. علاوة على ذلك ، تخضع نسبة كبيرة من البلاعم البرية لموت الخلايا بعد التعرض للنيجريسين ، كما تم قياسه بواسطة تحليل إطلاق LDH للطافات المزروعة ، في حين أن البلاعم التي تعاني من نقص في Caspase-1 لا تطلق LDH في المادة الطافية ، مما يشير إلى أن الخلايا لا تزال سليمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تكوين الالتهابات عن طريق الفحص المجهري الفلوري وتحديد مستوى تحلل الخلايا عن طريق قياس إطلاق LDH.

يمكن تعديل هذا الإجراء لاستخدام محفزات أو تدخلات التهابية أخرى تغير تنشيط الالتهاب أو داء الحمى