الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية
مارس 15, 2018
في هذه الورقة، ونحن مناقشة الاستعدادات المخ الثلاثة المستخدمة لتسجيل المشبك التصحيح خلية كله للدراسة على حلبة ريتينوتيكتال من الضفادع الصغيرة ليفيس النمو . ويساهم كل إعداد، بمزاياه الخاصة، المقاييس التجريبية من شرغوف النمو كنموذج لدراسة وظيفة الدوائر العصبية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية للخلية بأكملها من الخلايا العصبية في الكتلة البصرية الشرغوفة من أجل التعرف على نمط الاتصال أثناء التطور وفي النهاية لفهم كيفية تشكل الدوائر العصبية وعملها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التطور العصبي مثل كيفية تغير الخلايا العصبية على مدار التطور وكيف تعمل الدوائر لتؤدي إلى السلوك. الميزة الرئيسية لهذه المستحضرات هي أنها تسمح بالتسجيل الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية التكتمية البصرية لتوفير نظرة ثاقبة حول وظيفة الدوائر العصبية النامية.
سيوضح الإجراء Zhenyu Lui ، طالب دراسات عليا في مختبري. باستخدام ماصة نقل التخلص، انقل الشرغوف المخدر إلى طبق تسجيل التشريح الذي يحتوي على محلول تسجيل خارجي. قم بتأمين الشرغوف المخدر بكتلة سيليكون مغمورة على أرضية طبق التسجيل التشريح.
للحصول على رؤية واضحة للدماغ ، قم بإزالة الجلد الذي يغطي الدماغ عن طريق عمل شق سطحي على طول خط الوسط باستخدام إبرة معقمة قياس 25. قم بتقطيع الدماغ على طول نفس محور خط الوسط عن طريق إدخال الإبرة في الأنبوب العصبي والسحب برفق لأعلى بحيث يتم قطع الجزء الظهري من الأنبوب بشكل نظيف مع ترك لوحة الأرضية سليمة. لعزل الدماغ ، استخدم أولا إبرة قياس 25 لقطع الدماغ الخلفي.
ثم قم بتشغيل الإبرة برفق أسفل الدماغ في اتجاه ذيلية إلى منقاري لقطع جميع الأنسجة الضامة الجانبية والبطنية والألياف العصبية. بعد ذلك ، قم بتأمين الدماغ بكتلة من المطاط الصناعي السيليكوني عن طريق وضع دبوس واحد في إحدى المصابيح الشمية ودبوس آخر عبر الدماغ الخلفي. هذا هو التكوين الأمثل للتسجيل من الخلايا العصبية العقدية.
ثم انقل الطبق الذي يحتوي على مستحضر الدماغ بالكامل المثبت من نطاق التشريح إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية. قم بإزالة الغشاء البطيني باستخدام ماصة زجاجية مكسورة. لتنشيط محاور RGC مباشرة ، قم بخفض قطب محفز ثنائي القطب برفق على chiasm البصري بحيث يتم تشكيل انبعاج صغير في الأنسجة.
يجب أن يكون القطب المحفز ثنائي القطب منقاريا ومتجاورا تقريبا للبطين الأوسط الكبير حيث يوجد التصلب البصري. يتم تشغيل القطب ثنائي القطب بواسطة محفز نبضي يسمح بالتحكم بدقة في قوة التحفيز. لتحضير شريحة الدماغ الأفقية ، ابدأ بإعداد الدماغ بالكامل.
ثم استخدم شفرة حلاقة لاستئصال الربع الجانبي من جانب واحد من تكتيم بصري واحد. يتم إجراء هذا القطع بالتوازي مع المستوى الذيلي المنقاري. بعد ذلك ، أعد تثبيت الدماغ على جانب المطاط الصناعي السيليكوني بحيث يكون الجانب المقطوع متجها لأعلى بحيث يمكن الوصول إلى السوماتا والعصبية مباشرة للتسجيل ويواجه السطح البطيني للدماغ بعيدا عن كتلة المطاط الصناعي السيليكوني بحيث يمكن وضع قطب ثنائي القطب على التصلب البصري.
ثم قم بإجراء مشبك تصحيح الخلية بالكامل أو تسجيل محتمل المجال المحلي. فيما يلي الرسم التخطيطي الذي يوضح تكوين إعداد شريحة الدماغ الأفقية. لاحظ أنه على الرغم من أن القطب المحفز لا يزال في التصلب البصري ، إلا أن ماصة التسجيل موضوعة الآن للوصول إلى الخلايا عبر جميع الطبقات التكتالية المكشوفة بواسطة إعداد شريحة الدماغ الأفقية.
هذه استجابة تثيرها RGC من خلية عصبية موجودة في الطبقة السطحية من التكتوم. في هذا الشكل ، يتم عرض إمكانات المجال المسجلة عبر العصبية وكثافة المصدر الحالي المحول بواسطة مخطط الصورة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 10 دقائق وعادة ما تستمر لمدة تصل إلى ثلاث أو أربع ساعات.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحضير شريحة الدماغ بالكامل والأفقية لتسجيلات الخلية بأكملها من أجل تحديد الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية التكتالية واتصالها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة تقنيات تسجيل تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp) لدراسة الدائرة الشبكية السقفية في شرغوف Xenopus laevis. وتهدف هذه الأبحاث، من خلال استخدام تحضيرات دماغية مختلفة، إلى فهم أنماط الاتصال العصبوني في السقف البصري للشرغوف أثناء النمو، والوظيفة العامة للدوائر العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الفيزيولوجيا الكهربائية
- الدوائر العصبية
خلفية علمية
- استقصاء كيفية تشكل الدوائر العصبية وعملها في الكائنات النامية.
- تعد الدائرة الشبكية السقفية (retinotectal circuit) ضرورية للمعالجة البصرية في البرمائيات.
- تعمل شراغف Xenopus laevis كنموذج قيم لدراسة الاتصال العصبي.
- توفر تسجيلات الخلية الكاملة رؤى مفصلة حول النشاط العصبي.
الغرض من الدراسة
- لفهم أنماط الاتصال بين العصبونات في السقف البصري.
- لتحليل كيفية تغير العصبونات طوال فترة النمو.
- لاستكشاف كيفية مساهمة الدوائر العصبية في السلوك.
الطرق المستخدمة
- استُخدمت طرق تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (Whole cell patch clamp) لإجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية.
- تضمن النموذج البيولوجي أدمغة شرغوف مستأصلة لدراسة عصبونات السقف البصري.
- لم يتم ذكر أي مسارات عمل للمؤشرات المتعددة (multiomics).
- شملت الخطوات المحددة تثبيت الشرغوف، وعزل الدماغ، وإجراء تسجيلات مستهدفة.
- تسمح هذه الطرق بالتسجيل ضمن إطار زمني حرج مدته 10 minutes، وعادة ما تستمر لعدة ساعات.
النتائج الرئيسية
- سهلت التحضيرات بنجاح تسجيل نشاط العصبونات في السقف البصري.
- لوحظت تغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية تشير إلى وجود ترابط عصبي.
- دفعت النتائج إلى إجراء مناقشات حول الآثار الوظيفية للدائرة الشبكية السقفية.
- تساهم النتائج في فهم الدوائر العصبية النمائية.
الاستنتاجات
- يوضح هذا البحث طرقاً فعالة لدراسة الاتصال العصبي في أدمغة الشرغوف النامية.
- تعزز هذه الدراسة فهم وظيفة الدوائر العصبية أثناء النمو.
- تترتب على النتائج آثار أوسع نطاقاً في فحص العمليات والسلوكيات العصبية لدى البرمائيات.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية التنفيذية في المجال الصناعي
يتيح تسجيل تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (Whole cell patch clamp) في شرغوف Xenopus laevis استقصاءً عالي الدقة لتكوين الدوائر العصبية ووظائفها، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول الاتصال المشبكي والاستثارة العصبية أثناء النمو. يدعم هذا النهج التحقق من الأهداف في علم الأعصاب من خلال السماح بالقياس المباشر للاستجابات العصبية لمحفزات محددة، مثل النشاط المستحث بواسطة خلايا العقد الشبكية في السقف البصري. وتعزز قابلية هذه الطريقة للتكيف عبر التحضيرات في الجسم الحي (in vivo)، والدماغ الكامل، والشرائح الأفقية من قابلية التكرار والتوسع في تقليل المخاطر قبل السريرية لأهداف النمو العصبي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس الاستجابات العصبية للمدخلات الحسية، مما يوضح الاتصال الوظيفي في الدوائر النامية.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال القراءات الفيزيولوجية الكهربائية المباشرة للنشاط العصبي، مما يقلل من الغموض في تحديد مدى التفاعل مع الهدف.
- القيمة التنبؤية: تسهل عملية فرز المحافظ البحثية من خلال ربط الاضطرابات الجينية أو الدوائية بالتغيرات القابلة للقياس في استثارة العصبونات السقفية والتكامل التشابكي.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تجهيز أنظمة بيولوجية معتمدة لفحص المركبات اللاحق من خلال إنشاء تحضيرات عصبية مستقرة وقابلة للتسجيل ذات خصائص استجابة للمنبهات محددة.
- المخرجات الكمية: توليد قياسات فيزيولوجية كهربائية مثل التيارات بعد التشابكية وجهود المجال، مما يتيح تحليل الاستجابة للجرعة وتقدير كمية تأثير المركب.
- إعادة استخدام المنصة: يتيح تحضير شرائح الدماغ الأفقية التسجيل عبر جميع طبقات السقف البصري، مما يزيد من الإنتاجية والاتساق لجلسات تجريبية متكررة.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- الأهمية المرضية: ينمذج العمليات التطورية العصبية ذات الصلة بالاضطرابات التي تتضمن خللاً في توصيل الدوائر العصبية، مما يدعم استكشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- الاستمرارية قبل السريرية: يسد الفجوة بين مرحلتي الاكتشاف والتحقق من خلال تمكين التسجيل المتسق للوظائف العصبية عبر نقاط زمنية تطورية مختلفة.
- القرارات المعدلة وفقاً للمخاطر: يدعم معايير اتخاذ القرار بالاستمرار أو التوقف (go/no-go) بناءً على الأنماط الظاهرية الكهروفسيولوجية، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة من برامج التطور العصبي.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة مع تدفقات عمل الاكتشاف المبكر من خلال توفير التحقق الوظيفي للأهداف العصبية قبل تحسين المركبات الرائدة، حيث تساهم المخرجات في توجيه عملية اختيار الأهداف وفهم الآليات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تسجيل الاستجابات المستحثة من عصبونات السقف البصري بعد تحفيز محاور خلايا العقد الشبكية.
- الفحص: تتيح توحيد المقاييس من خلال تحضيرات قابلة للتكرار للدماغ الكامل والشرائح، مما يوفر قراءات فيزيولوجية كهربائية قابلة للقياس الكمي لفحص المركبات.
- التحليلات: تقدم قياسات كمية للمتغيرات التابعة مثل سعة التيار وفترة الكمون، مما يسهل المقارنة عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالصلاحية قبل السريرية من خلال الحفاظ على خصائص الدوائر ذات الصلة بالمرض عبر التحضيرات، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة فيزيولوجية كهربائية قابلة لإعادة الاستخدام وقابلة للتكيف مع سياقات تجريبية متعددة، مما يقلل من تكرار تطوير الطرق.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الأهداف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي عبر التسجيل العصبي المباشر.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي بين المختبرات من خلال بروتوكولات تحضير محددة لطرق القياس في الجسم الحي، والدماغ الكامل، والشرائح الدماغية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين الكشف المبكر عن المركبات غير الفعالة، مما يقلل الاستثمار في الأهداف غير القابلة للتطبيق.
- التأثير على المحفظة: تساهم في اتخاذ قرارات تطوير معدلة حسب المخاطر من خلال ربط النتائج الفيزيولوجية الكهربائية بالوظيفة على مستوى الدائرة العصبية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الفيزيولوجيا الكهربائية وتقنيات التشريح الجراحي المجهري لضمان تحضير الدماغ بشكل متسق.
- يعتمد على استقرار محاليل التسجيل خارج الخلوية وكفاءة معدات التحفيز للحصول على استجابات مستثارة موثوقة.
- يستلزم توحيد معايير بارامترات التحفيز وإعدادات التسجيل بين الفرق لضمان قابلية مقارنة البيانات.
- قد يتطلب التكيف عبر الأنظمة النموذجية إجراء تعديلات على طرق التشريح والزراعة بناءً على حجم الدماغ وإمكانية الوصول إليه.
- تشمل القيود العملية معدلات نجاح تعتمد على مهارة المشغل ومدى استقرار التحضيرات خلال جلسات التسجيل الممتدة.
