مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد خصوصية البروتياز في مستخلصات خام متعددة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لتحديد خصوصية البروتياز. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن تحديد خصوصية البروتياز لعينات متعددة في المكافآت.

تبريد: عينات أنسجة الرئة التي تم الحصول عليها من ذكور الفئران ICR في الجليد. قم بتجانس العينات عند 20 ، 000 RMP لمدة 30 ثانية في الخلاط. كرر هذه الخطوة حتى تصبح العينات متجانسة تماما.

لا تتجانس لأكثر من دقيقة واحدة بشكل مستمر لتجنب زيادة درجة الحرارة. انقل 1,000 ميكرولتر من الجانس إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 10,000 مرة جم عند أربع درجات مئوية. انقل 500 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب بلاستيكي جديد سعة 1.5 ملليلتر.

استخدم 10 ميكرولتر من العينة لتحديد تركيز البروتين. استخدام طرق ، مثل مقايسة حمض البيسنكونينيك أو اختبار برادفورد. لمنع التجميد ، أضف 80٪ جلسرين إلى العينات للحصول على تركيز نهائي قدره 50٪ جلسرين.

لتوضيح الاختلاف في خصوصية البروتياز اعتمادا على درجة الحموضة ، استخدم مخازن الهضم المعدلة إلى درجة الحموضة ثلاثة وخمسة وسبعة وتاسعة. في 890 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم ، أضف إما 10 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر أو TPCK trypsin ، أو 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من المكورات العنقودية الذهبية V8 البروتياز ، أو 10 ميكروغرام لكل ميكرولتر من مستخلصات الأنسجة. قم بإعداد الضوابط السلبية عن طريق تعطيل البروتياز في مستخلصات الأنسجة عن طريق الحضانة وغلي الماء لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من ركائز ملصق البيوتين MNO إلى العينات واحتضانها لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية للهضم. بعد الحضانة ، أوقف هضم الركائز بالماء المغلي لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي الركائز المهضومة لمدة خمس دقائق عند 10،000 مرة G عند أربع درجات مئوية.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 50 ملليلتر من 50٪ من حبات سيفاروز الستربتافيدين في مخزن مؤقت مولار واحد ، يحتوي على 0.1٪ بولي أوكسي إيثيلين أوكتيل فينيل إيثر. استخدم ورق اختبار الأس الهيدروجيني للتأكد من أن المحلول حوالي تسعة.

من المهم ضبط الرقم الهيدروجيني المناسب إلى تسعة أو أكثر. لا يمكن أن يعض البيوتين الأميني حبة ما لم يكن درجة الحموضة تسعة أو أعلى. إذا كان الرقم الهيدروجيني للمحلول منخفضا ، فاضبطه على الرقم الهيدروجيني التاسع تقريبا عن طريق إضافة المزيد من المخزن المؤقت.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة مخزن مؤقت واحد من الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر. احتضان التعليق طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع خلط لطيف مستمر على عجلة دوارة لربط ركائز MNO المسماة بالبيوتين بالستربتافيدين. يجب أن تظل الخرزات معلقة طوال فترة الحضانة.

في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة دقيقة واحدة عند 10،000 مرة G عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل الخرزات بإضافة 1،000 ميكرولتر من مخزن الغسيل. ثم احتضن لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية مع الخلط اللطيف المستمر على الدوار.

الطرد المركزي للحبات لمدة دقيقة واحدة عند 10،000 مرة G عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وكرر هذا الغسيل أربع مرات. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 0.2٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى الخرز.

استخدم ورق اختبار الأس الهيدروجيني للتأكد من أن المحلول أقل من الرقم الهيدروجيني الثاني. إذا كان الرقم الهيدروجيني للمحلول مرتفعا ، فاضبط الرقم الهيدروجيني إلى أقل من اثنين عن طريق إضافة 1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. احتضن نظام التعليق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط اللطيف المستمر على عجلة مدورة.

بعد الطرد المركزي للحبات كما كان من قبل ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. Pipet 20 ميكرولترا من الأسيتونيتريل على راتنج C18 لتنشيطه. قم بإزالة الأسيتونيتريل المستخدم وكرر خطوة التنشيط هذه ثلاث مرات.

بعد ذلك ، قم بموازنة راتنج C18 مع 20 ميكرولترا من 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. قم بإزالة المادة المشعثة وكرر خطوة التوازن هذه ثلاث مرات. لتحميل العينات ، اربطها بالراتنج باستخدام ماصة.

اغسل الراتنج ب 20 ميكرولتر من 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. كرر هذه الخطوة خمس مرات. قم بتخفيض العينات بثلاثة ميكرولترات من 60٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك.

Pipet المشتعث على لوحة مستهدفة للطفيف الكتلي MALDI-TOP. أضف على الفور محلول CHCA المشبع بنسبة 50٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. تبلور الخليط عن طريق التجفيف بالهواء.

الحصول على أطياف كتلة من العينات ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للأداة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لأطياف الكتلة من 700 إلى 900 دالتون للشكل المشقوق لركائز ملصقات البيوتين. تظهر هنا أطياف كتلة الركائز الاصطناعية. تم الكشف عن القمم المقابلة للوزن الجزيئي للسلائف بين 850 و 1 ، 050.

تم الكشف عن الشظايا المشقوقة في حدود 700 إلى 850. تظهر هنا أطياف الركائز المسماة بالبيوتين MNO المعالجة ب TPCK trypsin. تتوافق قمم دالتون 839.81 و 796.76 دالتون مع الشظايا المشقوقة من الطرف C لليسين والأرجينين على التوالي.

تظهر هنا الأطياف الكتلية للركائز الاصطناعية المهضومة باستخدام البروتياز V8. تتوافق قمم دالتون 769.78 و 755.62 دالتون مع الشظايا المشقوقة من الطرف C لحمض الجلوتاميك وحمض الأسبارتيك على التوالي. يتم هنا عرض أطياف ركائز ملصقات البيوتين MNO المعالجة بمستخلص أنسجة الرئة في ظروف الأس الهيدروجيني المختلفة.

في الحالة الحمضية ، عند درجة الحموضة خمسة ، كان الوزن الجزيئي للجزء المشقوق 770.13 دالتون و 826.66 دالتون ، مما يشير إلى الانقسام عند الطرف C لحمض الجلوتاميك والتربتوفان. في الحالة المحايدة والأساسية ، عند الرقم الهيدروجيني السابع والتاسع ، تمت زيادة الوزن الجزيئي للجزء المشقوق في ذروة 767 دالتون و 840 دالتون ، مما يشير إلى الانشقاق عند الطرف C من الأرجينين والليسين. على العكس من ذلك ، انخفضت قمم حمض الجلوتاميك والتربتوفان.

بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لهذه الطريقة اكتشاف الأجزاء المشقوقة بمستخلصات غير نشطة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، باستثناء تخليق الركيزة. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد تصنيع الركيزة ، يمكن قياسها في عدة عينات. لماذا؟

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في درجة الحموضة العازلة ، حوالي تسعة. بشكل عام ، رد فعل مركب أفيدين أمينو بيوتين. باتباع هذا الإجراء ، من الممكن تحديد نشاط الإنزيم عن طريق إجراء CMS.

ستسمح هذه الطريقة للباحثين في مجال البروتيون بتمهيد الطريق لاستكشاف تعبير البروتياز في عدة ظروف.