جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات
سبتمبر 5, 2018
عبر مجموعة واسعة من مؤشرات المرض، يجري النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا المخدرات المتقدمة وتنفذ في اكتشاف البرامج. النظام النموذجي الجديد الموصوفة هنا يوضح الورم ثلاثي الأبعاد كيف يمكن مثقف الماغنيسيوم وفرزهم في نظام القائم على لوحة الفائق 1536-جيدا للبحث عن أدوية جديدة لعلاج الأورام.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف الأدوية ، مثل ما هو إعداد زراعة الأنسجة الأكثر صلة لتحديد الضرب إلى الرصاص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بزراعة الخلايا في ثلاثة أبعاد ، بطريقة إنتاجية عالية ، باستخدام 1536 لوحة بئر. سيظهر هذا البروتوكول كالياني جامبا ، عالم كبير من مختبري.
لإعداد ثقافة كروية للورم ثلاثي الأبعاد ، افصل خطوط الخلايا السرطانية ذات الأهمية بثلاث غسلات من BBS. متبوعا بإضافة مليلتر واحد من التربسين لكل خمسة سنتيمترات مربعة من قارورة الاستزراع. بعد خمس دقائق ، قم بتحييد التربسين بخمسة أضعاف حجم الوسط المكمل في المصل في كل قارورة ، واحسب الخلايا.
استخدم كاسيت صغير معقم من الفولاذ المقاوم للصدأ مع نظام قائم على المضخة التمعجية لزرع ما مجموعه 500 خلية في ثمانية ميكرولتر من الوسط الكروي في كل بئر من 1،536 لوحة معالجة لزراعة الأنسجة البئرية. ثم استخدم ختم لوحة لاصقة قابلة للتنفس لتغطية اللوحة. وضع اللوحة في حاضنة دوارة على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 10 دورة في الدقيقة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة نسبية لمدة ثلاثة أيام.
الخطوةالوحيدة الأكثر أهمية هي التأكد من أن الألواح محكمة الغلق قبل وضعها في الحاضنة. ستحتاج الكرويات إلى ثلاثة أيام لتتشكل وهذه الخطوة تمنع التبخر المتوسط. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير ألواح الثقافة المبطنة بالسرطان بسرعة 100 ضعف الجاذبية لجمع أي تكاثف ، وإزالة الأختام اللاصقة.
ضع كل لوحة ليتم معالجتها على موزع صوتي تم إعداده لتوفير ما مجموعه ثمانية نانولترات من كل مركب. التخفيف إلى تركيز نهائي قدره 0.1٪ DMSO لكل بئر ، وجرعة مركبة عليا من 10 ميكرومولار. عندما تتم إضافة المركب إلى الألواح المناسبة ، ضع غطاء ثقافة خلية مصنوع حسب الطلب من الفولاذ المقاوم للصدأ على كل لوحة لمنع التبخر ، وأعد الألواح إلى حاضنة الغزل لمدة خمسة أيام أخرى.
في نهاية الحضانة ، أضف ثلاثة ميكرولترات من كاشف تحلل الخلية الدافئ مسبقا ، مع استكمال اللوسيفيرين إلى كل بئر من كل لوحة زراعة خلية. واحتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل. ثم التقط إضاءة ATP على مقياس إضاءة لوحة.
عندما يتم تحليل جميع الألواح ، قم باستخراج البيانات الأولية من الجهاز وتطبيع جميع الحقول التي تحتوي على مركبات الاختبار إلى متوسط جميع الآبار التي تحتوي على DMSO وحدها كعنصر تحكم محايد. يمكن بعد ذلك حساب النسبة المئوية لتثبيط النمو لكل مركب وفقا للصيغة ، ومنحنيات استجابة الجرعة ، ويمكن إنشاء IC50s المثبطة. شكلت مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية المعروفة بأنها تنمو بشكل جيد في ظل ظروف الثقافة ثنائية الأبعاد أيضا هياكل ثلاثية الأبعاد عند زراعتها كما هو موضح للتو ، على الرغم من اختلافاتها المورفولوجية.
عند استخدامها للفحص على نطاق واسع ، يمكن ملاحظة حساسية المركبات التفاضلية بين الثقافات المزروعة في 2D مقابل تلك المزروعة في 3D. مع كل نقطة تمثل التركيز المثبط لمركب واحد لوحظت استجابة قتل الخلايا بنسبة 50٪ في كلا إعدادات الثقافة. في هذه التجربة التمثيلية ، كانت كل من المركبات المثبطة لسلاح الجو الملكي البريطاني أكثر فاعلية في ظروف ثلاثية الأبعاد في ثقافة خط سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة التي تؤوي طفرة منشطة في بروتين KRAS.
ومع ذلك ، تظهر المركبات فاعلية مماثلة في كل من ثقافات خط سرطان القولون الكروية ثلاثية الأبعاد و 2D التي تحتوي على طفرة تنشيط G13D في KRAS. يسمح الاختبار ثلاثي الأبعاد أيضا بمراقبة ظاهرة تنشيط النمو المتناقضة ، والتي تحدث عندما يكون هناك تثبيط غير كامل لثنائيات سلاح الجو الملكي البريطاني في الخطوط الطافرة عالية النشاط لسلاح الجو الملكي البريطاني ، كما يتضح من نمو الخلايا بتركيزات منخفضة من الدواء ، والتي يتم قمعها بتركيزات عالية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال اكتشاف أدوية السرطان لاستكشاف ظروف استزراع بديلة لتحديد مواد كيميائية جديدة وفعالة مقابل أهداف معروفة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستعرض هذه المقالة طريقة مبتكرة لاكتشاف الأدوية باستخدام كرويات ورمية ثلاثية الأبعاد تمت زراعتها في نظام أطباق عالي الإنتاجية يحتوي على 1536 بئراً. يهدف هذا النهج إلى تعزيز ملاءمة إعدادات الزراعة النسيجية في تحديد الأدوية المحتملة لعلاج الأورام.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأورام
- اكتشاف الأدوية
- تقنيات زراعة الخلايا
خلفية علمية
- غالبًا ما تفشل المزارع الخلوية التقليدية ثنائية الأبعاد في محاكاة البيئة الدقيقة للأورام.
- توفر المزارع ثلاثية الأبعاد نموذجًا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة السرطان.
- يعد الفحص عالي الإنتاجية ضروريًا للاكتشاف الفعال للأدوية.
- تركز هذه الدراسة على تحسين استزراع الكريات الورمية.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة عالية الإنتاجية لاستنبات الكريات الورمية.
- تقييم مدى ملاءمة هذا النموذج في اكتشاف الأدوية.
- تسهيل عملية تحديد أدوية جديدة لعلاج الأورام.
الطرق المستخدمة
- فصل الخطوط الخلوية السرطانية باستخدام غسلات BBS.
- استخدام التريبسين لفصل الخلايا ومعادلته بوسط مُدعم بالمصل.
- زراعة الخلايا في أطباق ذات تنسيق 1536 بئراً.
- فحص المرشحين المحتملين من الأدوية بطريقة عالية الإنتاجية.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة باستزراع الكرويات الورمية ثلاثية الأبعاد بكفاءة.
- تمكّن قدرات الإنتاجية العالية من الفحص السريع للمركبات الدوائية المرشحة.
- إثبات أهمية نموذج الاستزراع ثلاثي الأبعاد في اكتشاف الأدوية.
- إمكانية تحسين عملية تحديد المركبات الواعدة (hit-to-lead).
الاستنتاجات
- تعزز طريقة زراعة الكريات الورمية ثلاثية الأبعاد (3D tumor spheroid) جهود اكتشاف الأدوية.
- توفر هذه الطريقة تمثيلاً أكثر دقة لبيولوجيا الأورام.
- يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى تحديد علاجات جديدة في مجال علم الأورام.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
تعالج هذه الطريقة الفجوة الانتقالية في اكتشاف أدوية الأورام من خلال تمكين الفحص عالي الإنتاجية في نموذج كروي ورمي ثلاثي الأبعاد (3D tumor spheroid) ذي صلة فسيولوجياً. وهي تدعم الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق الكشف عن الاستجابات الدوائية المتباينة بين ظروف الزرع ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D). كما يعزز هذا النهج من عملية تحديد المركبات الواعدة (hit-to-lead) لمثبطات مسار MAPK في نماذج السرطان المحددة وراثياً.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في نظام ذي صلة بالمرض يجسد التفاعلات الخلوية ثلاثية الأبعاد والتنظيم المكاني.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال مقارنة فعالية المركبات في المزارع ثنائية الأبعاد مقابل المزارع ثلاثية الأبعاد لتحديد النشاط المعتمد على السياق.
- القيمة التنبؤية: تسهل تحديد المركبات الرائدة من خلال الكشف عن الحساسية التفاضلية في نماذج سرطان الرئة غير صغير الخلايا الطافر في KRAS تحت ظروف ثلاثية الأبعاد.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر نظام استزراع ثلاثي الأبعاد مقنناً وقابلاً للتكرار، يتوافق مع تنسيقات الأطباق ذات 1536 بئراً لعمليات فحص المركبات على نطاق واسع.
- القيمة التشغيلية: يتيح قراءات تألق لوميني (luminescence) كمية تعتمد على ATP لقياس تثبيط النمو وإنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة وقيم IC50.
- جاهزية المقايسة: يستخدم التوزيع الصوتي لضمان دقة توصيل المركبات بحجم النانولتر، مع تحضين محكم لمنع التبخر، مما يضمن سلامة المقايسة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يعمل كجسر يربط بين الاكتشافات وسير العمل قبل السريري من خلال نمذجة التفاعلات بين الورم والسدى وظروف تشبه المصفوفة خارج الخلوية في تنسيق قابل للتوسيع.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يسمح بمراقبة تنشيط النمو المتناقض في طفرات dimer RAF، مما يوجه استراتيجيات العلاج المركب ويقلل من المخاطر المرتبطة بالمرشحات السريرية.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يدعم تقييم المثبطات النوعية للمسارات (مثل MAPK) في خلفيات محددة جينيًا لربط النمط الجيني بالاستجابة الدوائية.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة، مما يتيح التقييم المبكر لفعالية المركب في سياق أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية قبل الاستثمار في الدراسات قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال الكشف عن كيفية تأثير الزرع ثلاثي الأبعاد على الحساسية الدوائية في النماذج المدفوعة بالجينات المسرطنة، مثل سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) المتحور في KRAS.
- الفحص: توفر الجاهزية وقابلية التكرار للمقايسة من خلال تكوين كرويات نمطية في أطباق ذات 1536 بئراً مع بروتوكولات تحضين وختم محكمة.
- التحليلات: تتيح القياس الكمي للمتغير التابع عبر تطبيع التألق الحيوي لـ ATP بالنسبة لعناصر التحكم في DMSO، مما يسهل حساب IC50 وتحليل القوة المقارن.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية عن طريق نمذجة البنية المكانية للورم والتفاعلات النسلية الغائبة في الأنظمة ثنائية الأبعاد.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص خطوط خلوية سرطانية متنوعة ومكتبات مركبات تستهدف مسارات محفوظة مثل MAPK.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الآلي عبر المقارنة المباشرة لاستجابات الأدوية ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد.
- القيمة التشغيلية: توفر التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، والقابلية للتوسع من خلال تدفقات عمل الأطباق ذات الـ 1536 بئراً المتوافقة مع الأنظمة الروبوتية والتحضين المكتوم.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف عن العمل من خلال تحديد المركبات ذات النشاط المرتبط بسياق معين، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات المركبات الرائدة بناءً على الفعالية التفاضلية في النماذج ذات الصلة الفسيولوجية مع تعديل المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك تحييد التربسين، وعد الخلايا، والزراعة المعقمة.
- يعتمد على أجهزة مثل أنظمة الكاسيت القائمة على المضخات 연동ية، والموزعات الصوتية، والحاضنات الدوارة، ومقاييس الضوء للأطباق.
- يستلزم توحيداً قياسياً بين الفرق لبروتوكولات الختم، ومعاملات التحضين (37°C، 10rpm، 5% CO2، 95% رطوبة)، وإجراءات تطبيع البيانات.
- يتضمن اعتبارات تكييف لمختلف الخطوط الخلوية السرطانية، حيث قد تختلف كفاءة تكوين الكريات الخلوية على الرغم من نجاح تكوينها في الخطوط المعتمدة.
- يتضمن قيوداً عملية مثل الحاجة لمنع التبخر أثناء فترات التحضين الممتدة وتحسين جرعات المركبات بأحجام النانولتر.
