Seq كاريب ورقاقة Seq: أساليب لتحديد الكشف المرتبطة الكروماتين وتفاعلات البروتين-الحمض النووي في الخلايا الجذعية الجنينية

الهدف العام من CARIP-Seq هو مسح الحمض النووي الريبي المرتبط بالكروماتين على مستوى الجينوم. الهدف من ChIP-Seq هو تقييم تفاعلات البروتين والحمض النووي على نطاق عالمي في الخلايا الجذعية الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم التخلق والخلايا الجذعية ، وتحديد عوامل نسخ موقع الجينوم أو ربط منظم الوراثة أو إشغال تعديل الهيستون أو الحمض النووي الريبي المرتبط بالكروماتين في الخلايا الجذعية الجنينية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تسمح باستجواب غير متحيز على مستوى الجينوم للحمض النووي الريبي المرتبط بمكونات الكروماتين والتحديد العالمي لتفاعلات الحمض النووي للبروتين. على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبيولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع خلايا الثدييات الأخرى لدراسة بيولوجيا السرطان أو الأمراض البشرية الأخرى. لحصاد الخلايا الجذعية الجنينية ، اغسل الخلايا أولا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات.

ثم افصل الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين ، دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية. بعد التربسيني ، أعد تعليق الخلايا في وسط MEF دافئ مسبقا ، مع استكمال مصل بقري جنيني بنسبة 10٪. بعد ذلك ، أضف 37٪ فورمالديهايد إلى الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل إلى تركيز نهائي قدره 1٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق لربط الخلايا.

لإيقاف تفاعل التثبيت، أضف 1.25 مولر جلايسين مبرد مسبقا عند أربع درجات مئوية إلى تركيز نهائي قدره 0.125 مولار. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على محور دوار واقلبه بمعدل ثماني دورات في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، قم بالطرد المركزي للعينة على حرارة 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد انتهاء الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الحبيبات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المبرد مسبقا وقم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى. ثم قم بإزالة المحلول الملحي المخزن بالفوسفات وتجميد الخلايا في النيتروجين السائل لمدة دقيقة.

بمجرد إذابة الخلايا الجذعية الجنينية على الجليد ، أعد تعليق الحبيبات في 2.5 مل من المخزن المؤقت للصوتنة. لدراسة عوامل النسخ أو العوامل اللاجينية ، قم بإعادة تعليق بيليه الخلية في المخزن المؤقت للصوتنة بدون كبريتات دوديسيل الصوديوم. لتعديلات هيستون ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن مؤقت يحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم.

بعد ذلك ، بالنسبة للترسيب المناعي للكروماتين ، قم بصوتنة الكروماتين لمدة 14 إلى 18 دورة بسعة 40٪ مع 30 ثانية في وضع الراحة و 30 ثانية. لإذابة الكروماتين لعامل البروتين ChIP ، استكمل المخزن المؤقت للصوتنة ب 28 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم. بالنسبة لعوامل البروتين في تعديلات الهيستون ، أضف 28 ميكرولترا من ديوكسي كولات الصوديوم و 0.28 مل من 10٪ Triton X-100 واخلطهم جيدا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة على حرارة 10 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لمسح الكروماتين مسبقا. في أنبوب ربط منخفض سعة 1.5 مليلتر ، أضف 40 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي A أو G. بعد ذلك ، اغسل الخرزات ب 600 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وانقل الأنبوب مع الخرز على رف يحتوي على مغناطيس واحتضانه لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول الملحي المخزن بالفوسفات وأعد تعليق الخرز مرة أخرى في 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. إلى الأنبوب ، أضف ميكروغرامين إلى أربعة ميكروغرامات من الجسم المضاد واحتضنه عن طريق وضعه على دوار لمدة 40 دقيقة بمعدل ثماني دورات في الدقيقة لتعزيز ارتباط الجسم المضاد بالخرز. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات لغسل الخرز.

بعد الغسيل ، احتضان مستخلص الكروماتين المونيكل على دوار عند أربع درجات مئوية طوال الليل لترسيب البروتينات المرتبطة بالكروماتين. في اليوم التالي ، اغسل الخرزات واحتضانها باستخدام المخزن المؤقت RIPA ، ومخزن RIPA بالملح ، والمخزن المؤقت لكلوريد الليثيوم ، والمخزن المؤقت Tris-EDTA مع Triton X-100 ، ومخزن Tris-EDTA المؤقت ، كل منهما لمدة 10 دقائق على المدور. لفك الارتباط المتقاطع ل ChIP ، أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA.

ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم وخمسة ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل مليلتر من البروتيناز K ، واحتضان الخرزات عند 65 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة ، في اليوم التالي ، اقلب الأنابيب عدة مرات ، واتركها على الرف المغناطيسي ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، اغسل الخرزات المغناطيسية بإضافة 100 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA ، الذي يحتوي على 0.5 مولار كلوريد الصوديوم واجمع بين الطاف.

لفك الارتباط المتقاطع ل CARIP ، أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 10٪ وخمسة ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل مليلتر من بروتيناز K واحتضان الخرزات عند 65 درجة مئوية لمدة أربع إلى 12 ساعة. مرة أخرى ، اقلب الأنبوب عدة مرات وضعه على الرف المغناطيسي لنقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.

بعد ذلك ، اغسل الخرزات المغناطيسية بإضافة 100 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA ، الذي يحتوي على 0.5 مولار كلوريد الصوديوم ثم اجمع بين الطافيين. أخيرا ، اعزل عينة الحمض النووي الريبي باستخدام كحول إيزوأميل كلوروفورم الفينول في 25 إلى 24 إلى حجم واحد بنسبة الحجم. بعد ذلك ، استخدم DNase لإزالة الحمض النووي من عينة الحمض النووي الريبي المرسب المناعي المرتبطة بالكروماتين.

بعد ذلك ، أضف 10X DNase buffer إلى عينة CARIP واضبط الحجم النهائي على تركيز 1X. ثم احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتجميع الخيط الأول من الحمض النووي التكميلي عن طريق إعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة 10.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي وميكرولتر واحد من ثلاثة ميكروغرام لكل مليلتر من بادئات سداسية عشوائية.

لتغيير طبيعة الهيكل الثانوي ، أولا ، احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم على الجليد لمدة دقيقتين. ثم أضيفي المزيج الرئيسي إلى أنبوب PCR واحتضنه عند 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من 200 وحدة لكل ميكرولتر من اثنين وقم بتشغيل برنامج Thermocycler.

لتصنيع الخيط الثاني من الحمض النووي التكميلي ، قم بإعداد التفاعل على الجليد عن طريق إضافة الكواشف والمخزن المؤقت والإنزيمات. ثم ، قم بعمل دوامة لخلط الكواشف برفق واحتضانها عند 16 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد تصنيع الحمض النووي ، قم بتنقية الحمض النووي التكميلي باستخدام مجموعة تنقية PCR.

بعد ذلك ، قم بإلغاء تجزئة الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، واستخدم جهاز صوت حمام مائي وأنبوب 1.5 مليلتر لمشاركة الحمض النووي بحجم 250 إلى 500 زوج أساسي لمدة ثلاث مرات 10 دقائق أو أربع مرات 10 دقائق. ثم قم بإعداد المكتبة وإجراء تسلسل الجيل التالي. هنا ، تم التقاط صور تباين الطور للخلايا الجذعية الجنينية لتصور مستعمرات الخلايا الجذعية.

في هذا البروتوكول ، تمت زراعة الخلايا في وجود أو عدم وجود الخلايا الليفية الجنينية للفأر المعطلة انقساميا مع LIF و / أو GSK3i في وسط الثقافة لمنع تمايز الخلايا. بعد ذلك ، لتصور كفاءة صوتنة كروماتين الخلايا الجذعية الجنينية المتشابكة ، تم تحميل الحمض النووي المزدوج الشريطة صوتنة على هلام الاغاروز 2٪. تظهر صورة الجل الكروماتين المنفصم في حدود 200 إلى 500 زوج قاعدي.

بعد ذلك ، تم إنشاء مكتبات ChIP-Seq وتسلسلها باستخدام منصة تسلسل الجيل التالي لتقييم الإشغال على مستوى الجينوم لإنزيم معدل الهيستون وتعديلات الهيستون في الخلايا الجذعية الجنينية. من عرض متصفح UCSC المخصص ، يمكن رؤية ثلاثي ميثيل H3K4 المخصب ، وثنائي ميثيل H3K4 ، و KDM5B في جين منظم تعدد القدرات الأساسي ، POU5F1 وفي مجموعة HOXC. كما تم إجراء تحليل CARIP-Seq لتقييم الحمض النووي الريبي المرتبط بالكروماتين في الخلايا الجذعية الجنينية.

يظهر عرض متصفح UCSC المخصص إشغال الحمض النووي الريبي ثلاثي الميثيل المرتبط ب H4K20 و H4K20 في الخلايا الجذعية الجنينية. من نتائج CARIP-Seq ، يمكن تفسير أنه على الرغم من أن الحمض النووي الريبي مرتبط بثلاثي ميثيل H4K20 ، إلا أنه قد لا يتفاعل مع الموضع المعين. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مسح الحمض النووي الريبي المرتبط بالكروماتين باستخدام CARIP-Seq وتحديد تفاعلات الحمض النووي للبروتين على نطاق عالمي في الخلايا الجذعية الجنينية.