عضلة رافعة أوريس التحضير لدراسة انتقال الأعصاب الثدييات المشبك في ظروف الجهد

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل عضلة الرافعة الطويلة وأعصابها من أجل تسجيل التيارات المشبكية عند التقاطع العضلي العصبي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم وظائف الأعضاء المشبكي مثل الحجم الحالي للوحة النهاية والمحتوى الكمي واحتمال الإطلاق والعلاقات بين النقل العصبي واستثارة العضلات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية التفصيلية من مشبك واحد يمكن دمجها بسهولة مع التجارب البصرية للخلايا الحية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الوظيفة المشبكية والتواصل التغذية الراجعة بين العصب والعضلات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى تتراوح من ذبابة الفاكهة إلى الثدييات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن إعداد عضلات العصب في الثدييات هش ، وخاصة العصب. يمكن أن يكون الحصول على بيانات مشبك الجهد اللاحقة وتفسيرها بعناية أمرا صعبا أيضا.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. سيظهر الإجراء ستيف بيرك من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، تحت مجهر تشريح مجسم ، قم بعمل شق صغير في الجلد على ظهر الفأر على مستوى لوح الكتف.

استخدم زوجا من مقص التشريح المجهري. قطع الجلد فوق الرأس والظهر. بعد ذلك ، اسحب الجلد على طول الشق بالقرب من لوح الكتف.

قطع العضلات التي هي أدنى من LAL عن طريق البدء من لوح الكتف الأيمن. ثم ارفع الأنسجة المقطوعة برفق على يمين خط الوسط. قم بعمل قطع باتجاه الأذن اليسرى مع ضغط شفرات المقص على الجمجمة لإزالة عدة طبقات من العضلات الأدنى من LAL الأيسر.

تجنب قطع العصب الذي يعصب LAL الذي يلتف حول قناة الأذن ويدخل العضلات الموجودة على الجانب الإنسي من الأذن. استمر في قطع قناة الأذن مع الحفاظ على أكبر قدر ممكن من العصب متصلا. بعد ذلك ، قم بقطع الأنسجة الدهنية خلف قناة الأذن على طول الجزء البطني الجانبي من الأذن.

قطع على طول لوح الكتف الأيسر على غرار الإجراءات التي يتم إجراؤها على الجانب الأيمن لإزالة العضلات تماما من الماوس. بعد ذلك ، قم بقطع صيوان الأذن على طول القاعدة تاركا الجزء الغضروفي من الأذن متصلا ب LAL. اقلب العضلات بحيث يكون الجانب السفلي متجها لأعلى.

لعزل عضلة LAL ، ضع LAL والأنسجة المحيطة به في طبق بتري مع قاع مطاط مرن من السيليكون وقم بتثبيت الأنسجة المقطوعة في الأسفل. اغسل الأنسجة بشكل متكرر في محلول ملحي فسيولوجي. بعد ذلك ، ضع دبوس حشرة عبر قناة الأذن لتثبيت التحضير في مكانه.

باستخدام دبابيس أصغر ، قم بتثبيت الأنسجة المتبقية على الجانب الآخر من خط الوسط من LAL. استخدم زوجا من الملقط. اسحب الجلد برفق لأعلى على الجزء الجانبي من الأذن لتمديد العضلات للخارج ووضع دبوس صغير عبر الجلد.

كرر هذه الخطوة حتى يتم تثبيت الأنسجة جيدا في الطبق. قم بإزالة العضلات التي تغطي LAL وتلك المرتبطة ب LAL عبر النسيج الضام وتكون مشدودة بشكل خاص بالقرب من خط الوسط. بعد ذلك ، اسحب الطبقة العضلية العلوية واقطع النسيج الضام مع توجيه الشفرات نحو طبقة العضلات التي يتم سحبها.

اقطع باتجاه خط الوسط حتى حوالي 3/4 من الطريق إلى خط الوسط واستمر في إزالة طبقات العضلات حتى يبقى LAL فقط. أثناء عملية التنظيف ، تأكد من عدم تلف الأعصاب. بعد ذلك ، قم بإزالة بعض النسيج الضام المتبقي الذي يغطي LAL للمساعدة في انحسام الأقطاب الكهربائية.

قم فقط بإزالة الأنسجة التي يمكن إجراؤها بسهولة دون التعرض لخطر إتلاف LAL في هذه العملية. لتحديد العصب الذي يعصب LAL ، باستخدام محفز الأعصاب ، المس الأعصاب بمحفز العصب. عندما تنقبض العضلة ، يتم تحديد العصب الصحيح.

بعد ذلك ، أمسك الأنسجة القريبة من العصب بعناية واستخدم المقص الزنبركي لفصل العصب عن الأنسجة المحيطة بالأذن. لتقليل الضرر ، احتفظ بمعظم العصب مغروسا في بعض الأنسجة المحيطة والتي سيتم استخدامها لاحقا لتأمين العصب في طبق التسجيل. في هذه المرحلة ، يمكن للمحقق أن يأخذ استراحة لمدة ساعة طالما أن LAL مغمور في 20 مل أو أكثر من محلول ملحي فسيولوجي.

بعد ذلك ، قم بفك تثبيت العضلات ونقلها إلى إدراج المرحلة تحت مجهر التشريح لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية. دبوس العضلة في النهايات وعلى طول حافتها. ضع العصب بشكل عمودي على ألياف العضلات وقم بتثبيته في قاع الطبق من خلال بعض الأنسجة الزائدة التي تركت سليمة في نهاية العصب.

حافظ على الأنسجة مغمورة في محلول ملحي فسيولوجي في جميع الأوقات. لتجربة الفيزيولوجيا الكهربية ، قم بتأمين غرفة التروية باستخدام LAL إلى مرحلة المجهر. ضع القطب المرجعي في كوب مملوء بكلوريد البوتاسيوم ثلاثي المولار المتصل بغرفة التسجيل عبر جسر أجار.

في هذه المرحلة، ضع القطب الكهربائي المحفز للأعصاب على العصب. قم بتعريض LAL الإعدادي ل 4-Di-2-Asp لمدة 10 دقائق لتحقيق الإزهار الكافي لتصور الوصلة العصبية العضلية. بعد 10 دقائق ، استبدل محلول 4-Di-2-Asp بمحلول الكالسيوم العادي.

في غضون ذلك ، املأ الشعيرات الدموية الزجاجية بالمحاليل المناسبة لأقطاب استشعار الجهد وتمرير التيار. اضغط برفق على الشعيرات الدموية لإزالة أي فقاعات هواء وقم بتثبيت الشعيرات الدموية المملوءة في حامل القطب الكهربائي على المنصة. باستخدام مجهر مستقيم مع مجال ساطع قياسي وإضاءة الإزهار ، ابحث عن شريط ساطع من التقاطعات العصبية العضلية الخضراء الفلورية التي تعمل بشكل عمودي على ألياف العضلات على طول الإعداد بهدف التكبير المنخفض للانحرافات المائية.

بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى هدف تكبير أعلى للنمو المائي لتحديد تقاطع عصبي عضلي على الطبقة العليا من العضلات من أجل فحصه باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية. باستخدام المجال الساطع في المقام الأول ، ضع القطب فوق غشاء العضلات في حدود 100 ميكرون من التقاطع العصبي العضلي المحدد. يوضح هذا الشكل مثالا على النبضات الحالية واستجابات الجهد من ألياف LAL واحدة تحت مشبك تيار من فأر R62 من النوع البري البالغ من العمر 12 أسبوعا.

تم الحصول على السجلات في محلول ملحي فسيولوجي طبيعي ويشير وجود mEPPs إلى أن هذه السجلات مأخوذة من لوحة نهاية المحرك. فيما يلي تسجيل تمثيلي ل EPC واثنين من mEPCs التي تم الحصول عليها في ظل ظروف مشبك الجهد. يوضح هذا الشكل EPCs و mEPCs المتراكبة من ألياف تمثيلية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الخلايا الحية باستخدام أصباغ الغشاء مثل FM143 أو علم الأنسجة من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بامتصاص إطلاق الحويصلة أو التغيرات المورفولوجية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم وظائف الأعضاء لاستكشاف الانتقال المشبكي والتواصل بين الخلايا العصبية في الكائنات الحية التي تتراوح من ذبابة الفاكهة إلى الثدييات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل عضلة الرافعة الرافعة الطويلة المعصبة من أجل تسجيل التيارات المشبكية عند التقاطع العصبي العضلي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر الشديد في إزالة الأنسجة العضلية المجاورة ل LAL وعزل العصب.