الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

الهدف العام من هذه التجربة هو اختبار تأثير الاستئصال بالليزر لبعض الخلايا العصبية على نشاط الدائرة وسلوكها. باستخدام هذه التقنية التجريبية ، يمكننا فحص ضرورة الخلايا العصبية في الدائرة الأساسية للسلوك. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلتنا الرئيسية في مجال السلوك وعلم الأعصاب مثل كيفية إدراك الفريسة وكيف يتم إنشاء السلوك الذي يتم التقاطه بواسطة النشاط العصبي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استئصال الخلايا العصبية على وجه التحديد بسبب الوسم الجيني لهذه الخلايا العصبية وكذلك الدقة المكانية العالية لليزر. بعد رفع اليرقات وتركيبها في 2٪ من الاغاروز ذوبان منخفض وفقا لبروتوكول النص ، ضع يرقات الاغاروز المضمنة تحت مجهر المسح الضوئي بالليزر ثنائي الفوتون وابدأ نظام الفحص المجهري. افتح برنامج الحصول على الصور وتحت علامة تبويب الليزر انقر فوق زر التشغيل لتشغيل الليزر.

انتظر حتى تتغير حالة الليزر من مشغول إلى وضع مقفل. في علامة تبويب القنوات ، اضبط الطول الموجي لليزر على 880 نانومتر لاستئصال EGFP أو 800 نانومتر لاستئصال GCaMP. حدد العدسة الذاتية 20X عن طريق تحريك مسدس العدسة يدويا.

ثم انقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع ، وانقر فوق GFP لتغيير المسارات البصرية وعرض التألق مباشرة بالعين. قم بتوسيط دماغ يرقات أسماك الحمار الوحشي في مجال الرؤية ، ثم انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ للعودة إلى اثنين من المجهري الفوتوني وتعيين قوة الليزر والكسب. كسجل لشرط ما قبل الاستئصال ، انقر فوق مكدس Z لتحديد خيار مكدس Z.

بعد ذلك ، بعد التركيز على الطرف البطني لدماغ اليرقات ، انقر فوق الزر الأول لتعيين الحد الأدنى وبعد التركيز على الجزء الظهري من السطح الأقصى للدماغ ، انقر فوق الزر الأخير لتعيين الحد الأعلى. أخيرا ، انقر فوق الزر بدء التجربة لتشغيل الحصول على صورة مكدس Z. بعد ذلك ، حدد العدسة الذاتية 63X عن طريق تحريك مسدس العدسة يدويا.

ثم انقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع للتبديل إلى الفحص المجهري الفائي فلوري. قم بتوسيط الخلايا المراد استئصالها بالعين ثم انقر فوق علامة تبويب الاستحواذ للعودة إلى الفحص المجهري بالليزر. في علامة التبويب وضع الاكتساب ، قم بتعيين حجم الإطار إلى 256 × 256.

انقر فوق مباشر وراقب الخلايا العصبية ذات الأهمية. بعد ذلك ، بدءا من الجانب الظهري ، ابحث عن مستوى بؤري تكون فيه الخلايا المراد استئصالها في بؤرة التركيز. باستخدام وظيفة المناطق ، ضع علامة على مساحة دائرية صغيرة حوالي 1/3 حجم الخلية في قطر كل خلية عصبية كعائد استثمار.

اضبط سرعة المسح الضوئي على 13.9 ثانية لكل 256 × 256 بكسل وهو ما يتوافق مع وقت مكوث الليزر البالغ حوالي 200 ميكروثانية لكل بكسل أو 200 ميكروثانية لكل نصف ميكرون. أيضا ، اضبط دورة التكرار على أربع تكرارات. انقر فوق بدء التجربة لتنفيذ وظائف السلسلة الزمنية والتبييض.

قارن الصورة قبل الاستئصال بالصورة بعد الاستئصال في دورة السلسلة الزمنية للتأكد من اختفاء التألق في الخلايا المستهدفة. بعد ذلك ، حرك المستوى البؤري أعمق قليلا واختر المستوى البؤري التالي حيث تظهر الخلايا غير المطلقة. قم بتنفيذ وظيفة التبييض كما هو موضح للتو وكرر العملية حتى يتم استئصال جميع الخلايا في البنية العصبية ذات الاهتمام.

بعد الاستئصال ، افحص الخلايا بحثا عن التألق الملغى وكرر تشعيع الليزر إذا لزم الأمر. بعد التشعيع ، يجب استعادة اليرقات. قم بعمل قطع متعامدة صغيرة بعناية في الاغاروز حول اليرقات.

ثم انتظر حتى تسبح السمكة من الاغاروز من تلقاء نفسها عندما يتلاشى المخدر. بعد زراعة الباراميسيا وتخدير يرقة أسماك الحمار الوحشي وفقا لبروتوكول النص ، ضع اليرقات في 2٪ نقطة انصهار منخفضة ، وقم بإزالة أي أغاروز زائد على الفور بحيث يبدو سطح الاغاروز محدبا قليلا. باستخدام إبرة تشريح ، قم بتوجيه اليرقات بسرعة في وضع

بعد ذلك ، باستخدام سكين جراحي ، قم بعمل بعض الجروح الصغيرة في الاغاروز لإزالة الاغاروز حول رأس سمكة الحمار الوحشي مما يوفر مساحة للبارامسيوم للسباحة. قم بإزالة الأغروز المتبقي بعناية عن طريق سكب ماء النظام برفق على الغرفة. بعد ذلك ، ضع بارامسيوم واحد في غرفة التسجيل ليكون بمثابة حافز بصري.

ثم ضع غرفة التسجيل تحت مجهر epifluorescence مزود بكاميرا CMOS علمية وحدد عدسة موضوعية 2.5X. ابدأ تطبيق الحصول على الصور للكاميرا المجهزة. انقر فوق جزء التسلسل وحدد سجل القرص الثابت في الجزء.

في قسم إعداد المسح الضوئي، اضبط عدد الإطارات على 900 أو أي رقم إجمالي آخر مطلوب. في جزء الالتقاط، اضبط وقت التعريض الضوئي على 30 مللي ثانية والتجميع إلى اثنين في اثنين. انقر فوق مباشر في جزء الالتقاط لتحديد موقع اليرقات في عرض الكاميرا والتركيز عليها ثم انقر فوق إيقاف مباشر وانقر فوق زر البدء.

احفظ الفيلم بتنسيق cxd وحلل البيانات وفقا لبروتوكول النص. بعد إعداد نظام التسجيل السلوكي ووضع يرقة في غرفة التسجيل وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ماصة صغيرة لجمع 50 باراميسيا ووضعها في غرفة التسجيل. لوضع زلة غطاء أعلى غرفة التسجيل ، ضع قطرة صغيرة من الماء على زلة الغطاء قبل وضعها على سطح الماء في غرفة التسجيل لتجنب دخول الهواء إلى الغرفة.

ضع غرفة التسجيل في نظام الإضاءة. بعد ذلك ، ابدأ تسجيل الفاصل الزمني بمعدل 10 إطارات في الثانية لمدة 11 دقيقة. أخيرا ، قم بإجراء التحليل وفقا لبروتوكول النص.

في هذه التجربة مع خط Gal4 الذي يصنف النوى في المنطقة قبل الصعق ومجموعة سكانية فرعية من الخلايا العصبية للبصيلة الشمية. تم استئصال الخلايا العصبية قبل الصدفية بالليزر ثنائيا. تم استئصال الخلايا العصبية الشمية كعنصر تحكم.

تظهر النتائج أن ليزري الفوتون يمكن أن يستئصل الخلايا المستهدفة مع ترك الخلايا العصبية المجاورة غير متأثرة. في هذه التجربة ، تم التحقيق في الاتصال الوظيفي للخلايا العصبية السابقة التي تعرض محاورها نحو ILH بشكل متساو. أظهر كل من pretectum و ILH نشاطا عصبيا في الوجود القريب للفريسة مما يشير إلى أن كلا النشاطين العصبيين مدفوعان بصريا.

تم استخدام تصوير الكالسيوم أيضا لمراقبة النشاط العصبي في pretectum و ILH في اليرقات المستعصية قبل الصعق. أظهر الجزء الأيسر الذي تم استئصاله بالليزر نشاطا عصبيا متبقيا أو معدوما. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر ILH المماثل نشاطا عصبيا نازحا بشكل كبير مما يشير إلى أن المدخلات الرئيسية ل ILH تأتي من pretectum المماثل.

على النقيض من ذلك ، أظهر ILH على الجانب الآخر من pretectum المستبعد بالليزر نشاطا عصبيا مشابها للنشاط العصبي في pretectum المماثل ، مما يشير إلى أن ILH الأيمن يتلقى مدخلات من pretectum الأيمن. بمجرد إتقان الاستئصال بالليزر ، يمكن القيام به في حوالي ساعة واحدة لكل يرقة أسماك الحمار الوحشي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استئصال الخلايا العصبية المستهدفة فقط باستخدام تشعيع الليزر المناسب ، وتجنب التلف الناتج عن الحرارة بواسطة الليزر.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء استئصال الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى مثل الدماغ الأمامي أو الدماغ الخلفي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية مشاركة هذه الخلايا العصبية في الوظائف المعرفية أو الوظائف الحركية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب السلوكي لاستكشاف الدوائر العصبية الوظيفية في نماذج أسماك الحمار الوحشي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استئصال الخلايا العصبية بالليزر على وجه التحديد في دماغ يرقات أسماك الحمار الوحشي وتقييم العواقب الوظيفية والسلوكية.

لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويتوافق دائما مع تعليمات الشركة المصنعة أثناء إجراء هذا الإجراء.