جيل من الخلايا الظهارية الآنف البشرية الماغنيسيوم فردية التليف الكيسي Transmembrane الموصلية منظم الدراسة

يتمثل هذا الإجراء بشكل عام في توليد كرويات لخلايا الأنف البشرية والتي يمكن استخدامها في النهاية كمقايسة لدراسات CFTR الوظيفية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التليف الكيسي مثل تقييم استجابة الشخص الفردي للأدوية المتغيرة CFTR في نظام نموذج خارج الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن عددا كبيرا من الكرويات يتم إنشاؤها في إطار زمني سريع نسبيا من عينة خلية أنف صغيرة مما يسمح بإجراء اختبارات مكثفة.

ستظهر الإجراء لورين ستريكر وجيسيكا مونسيفيز ، الفنيان من مختبري. بعد معالجة وتوسيع الخلايا الظهارية للأنف البشري أو الخلايا الظهارية على الخلايا الليفية المغذية وفقا لبروتوكول النص ، قم بإحضار وسط التمدد المعد مسبقا ، ووسط التمايز ، ومحلول Trypsin EDTA بنسبة 0.1٪ ، و PBS المعقم إلى درجة حرارة الغرفة على مدار 30 دقيقة. ثم استخدم 70٪ إيثانول لتنظيف الحاويات ونقلها إلى خزانة سلامة حيوية نظيفة.

في خزانة السلامة الحيوية، استخدم ماصة باستور متصلة بخط تفريغ لشفط الوسط والتخلص منه من ثقافة HNE. ثم باستخدام ماصة مصلية نظيفة ، استخدم خمسة ملليلتر من PBS لغسل الطبق عن طريق إضافة المخزن المؤقت وتدويره وشفطه. أضف خمسة ملليلتر من محلول 0.1٪ Trypsin EDTA إلى المزرعة وأعده إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق.

ثم تحت المجهر المقلوب من أربعة إلى 10 أضعاف ، تأكد من انفصال الخلايا عن الطبق ، وتصبح مستديرة وتطفو. اضغط برفق على جانب طبق المزرعة لإخراج الخلايا وإذا لزم الأمر ، أعد احتضان الطبق لمدة خمس دقائق إضافية حتى يتم فصل معظم الخلايا. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف خمسة ملليلتر من وسط التمدد إلى الطبق واجمع كل السائل في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.

إذا ظلت الخلايا ملتصقة بطبق الثقافة بعد ثلاث جولات من التربسين ، فاستخدم مكشطة خلية معقمة لتحرير الخلايا المتبقية برفق ومع خمسة ملليلتر من وسط التمدد ، اغسل الكاشطة والطبق واجمع المحتويات في نفس الأنبوب المخروطي المسمى. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 360 مرة جم في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. شفط المادة الطافية واستخدم ملليلترا واحدا من وسط التمدد لإعادة تعليق حبيبات الخلية.

ثم استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. افصل عددا مناسبا من خلايا المرور التربسينية تفاضليا للحصول على تركيز نهائي يبلغ 500 ، 000 خلية لكل مليلتر من المصفوفة.

بالنسبة للوحة ذات أربعة آبار ، استخدم 200،000 خلية واجمعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لخليط الخلية بما لا يزيد عن 360 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، قم بشفط الوسط والتخلص منه بالكامل وبعناية ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية.

احتفظ بأنبوب الخلايا على الجليد عند عدم التعامل معه بنشاط. استخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد لإضافة 100 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر مخطط إلى الخلايا. مع عدم إفراغ طرف الماصة تماما لتجنب دخول فقاعات الهواء، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا بعناية وبدقة.

تحرك بسرعة لتجنب تصلب المصفوفة. لزرع 100 مليلتر من مصفوفة في كل بئر من لوحة ثقافة التلقيح الاصطناعي المكونة من أربعة آبار ، استخدم مقصا نظيفا لقص الجزء البعيد من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات من طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. قم بعمل قطرة 100 ميكرولتر من خليط مصفوفة الخلايا بعناية وببطء في وسط كل بئر ، مما يضمن بقاء القطرة كروية ولا تلمس جوانب البئر.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة حتى تصبح صلبة. ثم قم بعمل ماصة بعناية 500 ميكرولتر من وسط التمايز في كل بئر ، مع الحرص على عدم إزعاج سقوط المصفوفة. تأكد من أن الوسيط يغطي القطرة فقط وأضف المزيد إذا لزم الأمر.

لزراعة الأكروية HNE ، باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد ، قم بشفط كل الوسائط برفق من البئر مع تجنب المصفوفة التي ستدمر الكرويات. ثم باستخدام طرف ماصة جديد سعة مليلتر واحد مع تجنب لمس المصفوفة أو إزعاجها ، أضف برفق 500 ميكرولتر من وسط التمايز إلى البئر حول المصفوفة. استمر في احتضان الكرويات ، واستبدل وسيط التمايز ثلاث مرات أسبوعيا كما هو موضح للتو.

تحت المجهر المقلوب بتكبير 20X ، قم بتقييم التشكل الكروي يوميا. يجب أن تتشكل الكرات في غضون ثلاثة إلى خمسة أيام من الطلاء وتصل إلى مرحلة النضج في غضون 10 أيام تقريبا. يجب أن تلتصق HNEs بطبق الاستزراع وتشكل جزرا صغيرة في غضون 72 ساعة من البذر.

يتم عرض أمثلة على تكوين الجزر الجيدة والفقيرة في أسبوع واحد هنا. يجب أن تتوسع الجزر لتغطية الطبق على مدار 15 إلى 30 يوما. خلال الأيام الثلاثة إلى الأربعة الأولى من الثقافة ، يجب أن تبدأ الهياكل الكيسية الصغيرة في التكون في المصفوفة وتنضج على مدار 10 أيام تقريبا.

إذا تم طلاؤها بالكثافة الموصوفة ، فستحتوي الثقافات الناجحة على 50 إلى 100 كروي لكل قطرة مصفوفة. قد تكون اللومن واضحة نسبيا كما هو الحال مع CFTR من النوع البري أو مملوءة بالحطام الخلوي والمخاط كما هو الحال في كرويات التليف الكيسي. يظهر الإخفاء لتحديد المنطقة اللمعية للكرويات في هاتين اللوحتين.

تظهر هنا أمثلة على الثقافات الكروية غير الناجحة سيئة التكوين. كما هو موضح في هذه الرسوم البيانية من المقايسات الوظيفية ، يجب أن تنتفخ الكرويات من الأشخاص الذين يعانون من CFTR من النوع البري لأكثر من ساعة عند تحفيزها ويجب أن تنتفخ بشكل أقل أو تتقلص إذا تم تحفيزها في وجود مثبط CFTR inh-172. يجب أن تتقلص الكرويات من موضوع متماثل الزيجوت ل F508del-CFTR أو تنتفخ قليلا جدا مع زيادة التورم أو تقلص أقل عند تصحيحها دوائيا باستخدام معدلات CFTR VX809 و VX770.

بمجرد إتقانها ، يمكن زرع الخلايا الكروية في 15 إلى 20 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على إجراءات التشغيل النظيفة داخل خزانة السلامة الحيوية لتقليل مخاطر تلوث العينة وتجنب أي مخاطر على صحتك. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التثبيت والتلوين والفحص المجهري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول مورفولوجيا الخلية وتكوينها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد الخلايا الأنفية البشرية الأولية التي يمكن استخدامها كمقايسة شخصية لوظيفة CFTR. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية الأولية يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل الاستخدام المناسب لمعدات الحماية الشخصية عند تنفيذ هذا الإجراء.