استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل

الهدف العام من هذا الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز ثنائي الأبعاد شبه التغيير هو تأكيد عدم تجانس حجم ألياف الأميلويد أو الألياف الشبيهة بالأميلويد التي شوهدت خلال SDD-AGE التقليدي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات تجميع الأميلويد أو البروتين ، مثل ما إذا كان عدم تجانس الحجم الذي شوهد أثناء SDD-AGE التقليدي هو الحالة الأصلية للألياف في الجسم الحي أو نتيجة لتدهور البروتين أو تفككه أثناء الرحلان الكهربائي للهلام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها بسهولة في المختبر بدون معدات متخصصة.

لا توجد معدات إضافية مطلوبة بخلاف ما هو مستخدم في SDD-AGE التقليدي. أولا ، قم بزرع خلايا سرطان القولون HT-29 المنتجة للأميلويد في طبق زراعة أنسجة يبلغ طوله 10 سم. ثم احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، استخدم المحلول الملحي المخزن بالفوسفات لغسل الخلايا. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من التربسين إلى الخلايا ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد انفصال الخلايا عن طبق الاستزراع ، أضف 10 مل من وسط الثقافة إلى الطبق.

ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 1 ، 000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسط وإعادة تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع.

عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. ثم اترك لوحين للاستزراع عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، أضف كواشف TSZ إلى أحد أطباق الثقافة كعلاج.

بعد حوالي ست ساعات ، قم بحصاد الخلايا باستخدام مكشطة بلاستيكية. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم, اغسل حبيبات الخلية مرتين ب 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج, وكرر عملية الطرد المركزي.

بعد ذلك ، قم بشفط محلول PBS ، وانقل حبيبات الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف 0.3 مل من المخزن المؤقت للتحلل إلى حبيبات الخلية ، واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة. مرة أخرى ، جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

المادة الطافية التي تم الحصول عليها هي محللة الخلية بأكملها. إلى المادة الطافية ، أضف 4X SDD-AGE BUFFER لتحضير 20 ميكرولتر من ثلاثة ميكروغرام لكل ميكرولتر من العينة. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

لتحضير الجل ، أضف جرامين من مسحوق الاغاروز إلى 200 مل من محلول TAE في دورق زجاجي. ثم سخني الدورق في الميكروويف لإذابة الاغاروز. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من 20٪ SDS إلى التركيز النهائي 0.1٪ قم بتدوير الدورق برفق.

بعد ذلك ، صب سائل الاغاروز على لوح هلام 15 × 14 سم. لإزالة أي فقاعات هواء، استخدم ماصة سعة ملليلتر واحد. ثم ضع مشطا بسعة 20 جيدا فوق الجل.

بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 60 ميكروغراما من محللة الخلية الكاملة في أقصى الممر الأيمن من الجل. قم بتشغيل الجل عند 60 فولت لمدة أربع ساعات تقريبا باستخدام المخزن المؤقت TAE الذي يحتوي على 0.1٪ SDS كمخزن مؤقت للتشغيل. لتشغيل الجل في البعد الثاني ، قم بتدوير الجل بعناية بمقدار 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة.

ثم قم بتشغيل الجل بجهد 60 فولت لمدة أربع ساعات تقريبا. في حاوية 20 × 20 سم ، أضف 500 مل من المخزن المؤقت للنقل. بجوار الحاوية مباشرة ، قم بإعداد كومة من المناشف الورقية بارتفاع خمسة سنتيمترات.

بعد ذلك ، انقع ورقتي ترشيح ، أبعاد كل منهما 14 × 15 سم ، في مخزن مؤقت للنقل ، وضعه فوق كومة المناشف الورقية. قم بتنشيط غشاء PVDF مقاس 14 × 15 سم في الميثانول لمدة 30 ثانية. بعد التنشيط ، ضع الغشاء أعلى أوراق الترشيح ، واستخدم أسطوانة لإزالة جميع الفقاعات.

جزء في النقل هو التأكد من عدم تكوين فقاعات هواء بين الجل والغشاء. اشطف الجل بمحلول النقل ، وضعه فوق الغشاء. طرح أي فقاعات تشكلت.

بعد ذلك ، استخدم غلافا بلاستيكيا لتغطية حافة المناشف الورقية الأقرب إلى حاوية النقل العازلة. بعد ذلك ، انقع قطعة من ورق الترشيح بأبعاد 15 × 35 سم في المخزن المؤقت للنقل. ضع ورق الترشيح بحيث يغطي أحد طرفيه الجزء العلوي من الجل والطرف الآخر في حاوية المخزن المؤقت للنقل.

غطي الحاوية بغلاف بلاستيكي واتركيها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، اشطف الغشاء ب 50 مل من PBST في وعاء 20 × 20 سم. بعد ذلك ، أضف 20 مل من الحليب بنسبة 5٪ في PBST على الغشاء.

ثم اترك الغشاء على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى يتم منعه. ماصة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة للأرانب المضادة ل MLKL إلى 20 مل من 5٪ حليب في PBST. ثم أضف مزيج الجسم المضاد على الغشاء.

احتضان الغشاء على الروك طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الغشاء ب 20 مل من PBST لمدة خمس دقائق. يتكرر هذا الغسيل خمس مرات.

بعد ذلك ، قم بتعبئة أربعة ميكرولترات من الأجسام المضادة للأرانب المضادة ل HRP إلى 20 مل من الحليب بنسبة 5٪ في PBST. أضف الجسم المضاد على الغشاء. اترك الحاوية مع الغشاء على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بعد ساعتين ، اغسل الغشاء خمس مرات في 20 مل من PBST لمدة خمس دقائق لكل منهما. أخيرا ، أضف ركيزة تلألؤ كيميائي محسنة على الغشاء. ثم قم بتعريض الغشاء لفيلم الأشعة السينية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

تم إجراء هذه الدراسة لإثبات وجود ألياف شبيهة بالأميلويد مقاومة ل SDS في محللات الخلية الكاملة التي يتم الحصول عليها من الخلايا المعالجة بعامل نخر الورم ألفا. يظهر هنا أن RIPK1 و RIPK3 يظهران أنماطا متطابقة تشبه الأميلويد. ومن المثير للاهتمام أن ألياف MLKL تبدو غير متجانسة مع نمط هجرة مختلف عن غيرها.

توضح هذه الصورة نمط الهجرة المحتمل للألياف النشوانية أو الشبيهة بالأميلويد. في البعد الأول SDD-AGE ، تظهر ألياف الأميلويد أو الألياف الشبيهة بالأميلويد مسحة مميزة. في هذه الصورة ، تهاجر الألياف بشكل متماثل في الجولة الثانية وتظهر نمطا قطريا للهجرة على الغشاء عند 45 درجة.

هذا يدل على أن الألياف لا تخضع للتدهور أو التفكك أثناء عملية تشغيل الجل. على العكس من ذلك ، إذا انفصلت الألياف ، فهناك خطوط رأسية أسفل الخط القطري ، مما يشير إلى هجرة أسرع للألياف الأصغر أثناء الرحلان الكهربائي الثاني. يظهر كل من هذين البعدين الأول والثاني SDD-AGE أن ألياف MLKL لا تنفصل أثناء عملية SDD-AGE وتختلف بالفعل عن ألياف RIPK1 و RIPK3.

في هذه الصورة ، تظهر ألياف MLKL مسحة مميزة خلال البعد الأول. ومع ذلك ، تظهر نفس الألياف خطا قطريا حادا بدون خطوط رأسية في البعد الثاني SDD-AGE. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جميع الظروف ، مثل الجهد وطول التشغيل ، تظل كما هي بين البعدين الأول والثاني لضمان خط حاد بزاوية 45 درجة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تجريد الغشاء وإعادة الفحص بالأجسام المضادة الأخرى ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما إذا كانت الألياف تحتوي على بروتينات أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التأكد من عدم حدوث أي تدهور أو تفكك في الأميلويد أو الألياف الشبيهة بالأميلويد خلال SDD-AGE التقليدي.