عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحويصلات خارج الخلية عن وسط البلهارسيا الياباني للبالغين المزروع في المختبر. يمكن لهذه الطريقة عزل EV بكفاءة في وسط الثقافة المختبرية عن البلهارسيا الياباني البالغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على عزل الحويصلة خارج الخلية بكفاءة عن وسط الثقافة المختبرية قصير المدى ، والتي يمكن أن تقلل من الإجهاد الذي يحتمل أن يؤدي إلى إفراز EV غير فسيولوجي.

سيكون العرض التوضيحي من قبل جونتاو ليو ، فني من مختبري. اجمع الطفيليات في دورق سعة 500 مل ، واغسلها جيدا ولكن برفق ثلاث مرات باستخدام 200 مل من PBS الدافئ. حافظ على الغسالات قصيرة ، واستخدم ترسيب الجاذبية لفصل الطفيليات.

بعد ذلك ، على أطباق 90 ملم ، ضع حوالي 200 زوج من الدودة لكل طبق. في الطبق ، اغسل الطفيليات مرتين أخريين باستخدام ترسيب الجاذبية. لهذه الغسلات ، استخدم وسط RPMI دافئ مكمل ببكتيريا القلم.

استبدل الغسيل الثاني ب 40 مل من الوسط بدون مضادات حيوية. ثم استزراع الطفيليات عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، انقل الوسائط من الألواح إلى أنابيب الطرد المركزي ، ثم اجمع البيض وبقايا الديدان عند 2،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

ثم اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون ، واجمع المحلول المصفى في كيس غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي 3.5 كيلو دالتون. بعد ذلك ، قم بغسيل المحلول باستخدام محلول 8٪ PEG8000 عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

هذه الخطوة مهمة لزيادة محصول الحويصلات خارج الخلية. في اليوم التالي ، انقل المحلول المحلل إلى أنبوب جديد ، وأضف 0.5 حجم من كاشف عزل الإكسوسوم الكلي. اخلطي المحلول حتى يصبح متجانسا ، واحتضنه عند حوالي خمس درجات مئوية طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 15،000 جم لمدة ساعة واحدة عند حوالي خمس درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية والتخلص منها ، وأعد تعليق حبيبات المركبات الكهربائية في ملليلترين من PBS. من المحتمل ألا تكون الحبيبات مرئية.

لتحليل اللطخة الغربية ، حدد أولا تركيز البروتين للعينة ، كما هو الحال مع مقايسة BCA. بعد ذلك ، قم بإعداد 10 إلى 20 ميكروغراما من المركبات الكهربائية في 22.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPA. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 4X ، وقم بتسخين الخليط على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد المعالجة الحرارية ، افصل بروتينات الحويصلة خارج الخلية على جل SDS-PAGE بنسبة 12٪. بعد تشغيل الجل ، يتم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF. فحص الغشاء بالأجسام المضادة ل CD63 بتخفيف واحد إلى 1,000.

بعد ذلك ، عالج الغشاء ب IgG-HRP المضاد للأرانب عند تخفيف من واحد إلى 5 ، 000. الآن ، استخدم كاشف الكشف عن ECL لتطوير الغشاء ، واتبع التحليل على نظام التصوير الكيميائي. ابدأ بنقل خمسة ميكروغرامات من العينة إلى أنبوب طرد مركزي فائق من مادة البولي بروبيلين ، واضبط الحجم على 12 مل باستخدام وسيط RPMI-1640.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 110 ، 000 جم لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بالشفط بعناية والتخلص من المادة الطافية. ثم, قم بإعداد تعليق حويصلة خارج الخلية 2X عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المخفف C إلى الحبيبات.

أعد تعليق الحبيبات مع ماصة لطيفة. الآن ، قم بإعداد محلول صبغ 2X طازج. أضف ميكرولترين من الصبغة الإيثانولية PKH67 إلى مليلتر واحد من المخفف C في أنبوب ميكروفيوج ، واخلطه جيدا.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ العينة عن طريق خلط المحاللين معا واحتضان المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. بعد ذلك ، أوقف التلوين بإضافة أربعة ملليلتر من FBS والانتظار لمدة دقيقة أخرى. بعد ذلك ، أضف وسيط RPMI-1640 لضبط مستوى الصوت إلى 12 مليلتر ، وقم بتدوير التعليق لعزل الحويصلات الملطخة.

قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. بعد ذلك ، أعد تعليق المركبات الكهربائية المحببة التي تحمل علامة PKH67 في 12 مل من وسط RPMI-1640. ثم كرر الطرد المركزي ، ولكن هذه المرة اجمع الحويصلات في مليلتر واحد من PBS.

لمقايسة الامتصاص ، قم بإعداد مزارع بين عشية وضحاها لخلايا الثدييات في أطباق مكونة من ستة آبار. في صباح اليوم التالي ، أضف خمسة ميكروغرامات من الحويصلات المسماة PKH67 إلى كل بئر ، واستمر في الاستزراع لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين.

ثم قم بإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة ، واغسلها مرتين باستخدام PBS ، وقم بتلطيخها ب DAPI قبل التصوير. تم جمع البلهارسيامات في مرحلة الكبد من الأرانب بعد 28 يوما من الإصابة. ثم تم جمع الحويصلات خارج الخلية من ديدان البلهارسيامات وتحليلها.

تراوح حجم الجسيمات ، كما هو محدد من خلال تحليل الجسيمات النانوية في مالفيرن ، بين 100 و 400 نانومتر ، مع اقتراب الجزء الأكبر من السكان من 220 نانومتر. كشف المجهر الإلكتروني للإرسال أن الحويصلات خارج الخلية مستديرة وقطرها يتراوح بين 100 و 200 نانومتر. أشار تحليل النشاف الغربي إلى أنه تم التعرف على الحويصلات المعزولة خارج الخلية باستخدام الأجسام المضادة CD63 ، وهي علامة حويصلة نموذجية خارج الخلية.

أظهر الفحص المجهري الفلوري للحويصلات خارج الخلية المسماة PKH67 التي تم استيعابها بواسطة خلايا استنساخ NCTC 1469 أن الحويصلات خارج الخلية تم توزيعها بشكل أساسي في سيتوبلازم الخلايا المتلقية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل EV في وسط الثقافة المختبرية عن البلهارسيا الياباني البالغ.