تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

الهدف العام من تحليل بصمة أصابع القدم هذا هو مراقبة تكوين مجمع بدء الترجمة على mRNAs للثدييات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ترجمة الرنا المرسال ، مثل بدء الترجمة بوساطة IRES. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء إجراء تحليل مفصل لتكوين مجمع بدء الترجمة على mRNA معين.

قم بتجميع تفاعلات النسخ لنسخ الحمض النووي الريبي من قوالب الحمض النووي المضخم PCR ، وترميز XIAP IRES RNA أو طفراتها. بعد ذلك ، أضف وحدتين من DNase الخالي من RNase لإزالة قالب الحمض النووي لكل تفاعل 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الحمض النووي الريبي المعالج DNase بالماء الخالي من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 110 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 110 ميكرولتر من حمض الفينول لبدء تنقية الحمض النووي الريبي. دوامة العينات لمدة خمس ثوان وأجهزة الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

من الأهمية بمكان تخفيف الحمض النووي الريبي أو CDNA قبل استخراج الفينول. إذا كان الحجم منخفضا جدا ، فسيكون من الصعب استعادة المرحلة المائية فعليا وسيكون العائد النهائي منخفضا. بعد ذلك ، انقل بعناية 100 ميكرولتر من الطور المائي المحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

أضف 10 ميكرولترات من أسيتات الصوديوم 3 M ، درجة الحموضة 5.5 ، واخلط العينات. بعد ذلك ، أضف ثلاثة أحجام من الإيثانول بنسبة 100٪ لترسيب الحمض النووي الريبي ودوامة العينات لمدة خمس ثوان. احتضن بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 20،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول المثلج 70٪ وكرر الطرد المركزي. استنشق بعناية أكبر قدر ممكن من المواد الطفية دون إزاحة الحبيبات.

ثم, جفف الحبيبات بالهواء لمدة خمس إلى 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في ماء خال من النوكلياز إلى تركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر. لبدء مقايسة طباعة أصابع القدم ، أضف 15 ميكرولترا من محللة الخلايا الشبكية للأرانب غير المعالجة بالنوكلياز إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، والذي يمثل النوع البري XIAP IRES RNA والطفراته.

أضف مثبط RNase و ATP و GMP-PNP إلى كل أنبوب. احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المعني إلى كل أنبوب واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية.

خلال فترة الحضانة ، أضف DTT و spermidine إلى المخزن المؤقت لبصمة أصابع القدم. ثم أضف 22 ميكرولترا من المخزن المؤقت لطباعة أصابع القدم إلى كل أنبوب واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة الأشعة تحت الحمراء المسمى طلاء القدم التمهيدي واحتضان التفاعل على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من dNTPs ، وميكرولترين من أسيتات المغنيسيوم ، وميكرولتر واحد من النسخ العكسي لفيروس الأرومة النخاعية للطيور. ارفع الحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر مع عازلة طباعة أصابع القدم. بعد ذلك ، اترك تمديد التمهيدي يحدث لمدة 45 دقيقة عند 30 درجة مئوية.

من الأهمية بمكان أيضا إضافة أسيتات المغنيسيوم إلى تفاعل بصمة أصابع القدم ، والذي بدونه لن يعمل النسخ العكسي على النحو الأمثل. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. أضف 250 ميكرولتر من 25: 24: 1 الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل ، درجة الحموضة 8.0 ، لبدء تنقية الحمض النووي (ك).

بعد دوامة العينات لمدة خمس ثوان ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 20،000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، انقل المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. ثم أضف ثلاثة أحجام من الإيثانول بنسبة 100٪ لترسيب الحمض النووي والدوامة لمدة خمس ثوان.

احتضن بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 20،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. ثم, اغسل حبيبات الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من المثلج البرد 70٪ الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

استنشق أكبر قدر ممكن من المواد الطافية ، مع الحرص على عدم إزاحة الحبيبات. ثم, جفف الحبيبات بالهواء لمدة خمس إلى 10 دقائق. قم بإذابة حبيبات الحمض النووي في ستة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز.

ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل الفورماميد. استخدم مجموعة تسلسل لإعداد سلم تسلسل نيوكليوتيدات ثنائي الأكسجين باستخدام برايمر بصمة أصابع القدم وبنية الحمض النووي التي تشفر XIAP IRES RNA. بعد ذلك ، امزج ستة ميكرولترات من كل تفاعل تسلسل مع ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل الفورماميد.

بعد تنظيف الألواح وتجميعها ، اسكب الجل وأدخل المشط. بعد بلمرة الجل ، قم بتجميع جهاز التسلسل واملأ الخزانات ب 1x TBE. بعد ذلك ، قم بالتشغيل المسبق عند 1500 فولت لمدة 15 دقيقة حتى تصل درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية.

سخني جميع العينات بصبغة فورماميد إلى 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولتر واحد من كل عينة على جل تسلسل بولي أكريلاميد بنسبة 6٪ وقم بتشغيل الجل عند 1500 فولت لمدة ثماني ساعات. أخيرا ، اقرأ العصابات في الوقت الفعلي باستخدام جهاز تصوير قائم على الفلورسنت.

توضح هذه الطريقة أن تأكيد الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية لتكوين مجمع بدء الترجمة. ينتج عن النسخ العكسي لمركب الريبوسوم XIAP mRNA بصمات أصابع نموذجية من 17 إلى 19 نيوكليوتيد في اتجاه مجرى النهر من AUG. يظهر طفرة 5'PPT ضعف تكوين بصمة إصبع القدم.

ومع ذلك ، عند النسخ باستخدام الغطاء 5's ، يحدث تكوين مجمع البدء. وبالمثل ، يظهر طفرة 3'PPT أيضا ضعف تكوين بصمة إصبع القدم. ومع ذلك ، فإن النسخ باستخدام الغطاء 5's يؤدي إلى تكوين مجمع البدء.

إن طفرة PPT المزدوجة التي تؤوي كل من طفرات 5'PPT و 3'PPT قادرة على تشكيل مجمع البدء بدون 5'cap. يضعف تكوين بصمة القدم بشدة لطفرة كودون البداية في غياب RRL و GMP-PNP وذيل Poly A. تتم مقارنة منتجات CDNA بسلم تسلسل نيوكليوتيدات ثنائي الأكسجين.

يظهر بيتا جلوبين البشري ، أو HBB mRNA ، أي بصمة إصبع في حالة عدم وجود غطاء 5'. ومع ذلك ، يتم تشكيل مركب البدء على 5'UTR المغطى لسداسي البروم ثنائي الدهور ، مما ينتج عنه بصمات أصابع من 16 إلى 18 نيوكليوتيد في اتجاه مجرى النهر من AUG. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاثة أيام ، بما في ذلك تحضير قوالب النسخ في المختبر والحمض النووي الريبي ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص الهيكلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الهيكل الثانوي للمتغيرات البرية أو المتحولة من IRES. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ترجمة الرنا المرسال لاستكشاف الترجمة بوساطة IRES في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء طباعة أصابع القدم للحمض النووي الريبي المرسال للثدييات وتحليل تكوين مجمعات بدء الترجمة.

لا تنس أن حمض الفينول والفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والأكريلاميد يمكن أن تكون خطيرة للغاية. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء استخدام هذه الكواشف.