فيروس تقديم أدلة كريسبر للبروستاتا موريني لتحوير الجينات

الهدف العام من هذا الإجراء الجراحي هو تغيير التعبير الجيني في البروستاتا الفئران عن طريق التوصيل الفيروسي لأدلة كريسبر كاس9 لتحريض سرطان البروستاتا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الجديدة في بيولوجيا سرطان البروستاتا فيما يتعلق بتحليل الجينات الجديدة والتحقق من صحتها في بيئة في الجسم الحي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالتحرير الجيني السريع لجينات متعددة من خلال استهداف مجموعة فرعية فقط من خلايا البروستاتا كما هو موضح في السيناريو البشري.

قد يعاني الشخص الجديد في الإجراء في البداية بسبب حجم الأعضاء والدقة اللازمة لإكمال الجراحة بنجاح. لتحضير حجم إجمالي قدره 5 ملليلتر من التخدير ، امزج 0.15 ملليلتر من ملغ واحد لكل مليلتر من هيدروكلوريد ميديتوميدين ، و 0.4 مل من 5 مجم لكل مليلتر من الميدازولام ، و 0.25 مل من 10 مجم لكل مليلتر من البوتورفينول. ثم أضف 4.2 مل من الماء المالح المعقم.

لعكس آثار ميديتوميدين هيدروكلوريد بعد الجراحة ، امزج 0.1 مليلتر من 5 مجم لكل مليلتر أتيباميزول مع 4.9 مل من الماء المالح المعقم كترياق للتخدير. إعداد بيئة جراحية معقمة عن طريق التطهير والتعقيم المناسبين وتعقيم الأدوات الجراحية. لتوصيل الفيروس إلى البروستاتا ، بعد تخدير فأر ذكر يبلغ من العمر ثمانية أسابيع وفقا لبروتوكول النص ؛ افحص عمق التخدير من خلال تقييم استرخاء العضلات وسحب الدواسة وردود الفعل الملموسة.

عندما يلاحظ فقدان ردود الفعل ، احلق أسفل بطن. باستخدام قطعة قطن معقمة ، قم بتغطية عيون بعناية بمرهم بيطري للعيون لمنع العمى الناجم عن جفاف الملتحمة. ثم استخدم 70٪ إيثانول و 10٪ من اليود لمسح البطن المحلوق لتطهير منطقة الجراحة.

بعد ذلك ، باستخدام مقص جراحي معقم ، قم بعمل شق جلدي عمودي يبلغ طوله سنتيمترا واحدا تقريبا عند خط الوسط السفلي للبطن. ثم ، باستخدام ملقط دقيق ، ارفع الصفاق لمنع إتلاف الأعضاء الموجودة تحتها ؛ واستخدم المقص الجراحي لعمل شق بعناية بمقدار ثمانية ملليمترات أو أقصر عبر الصفاق. حرك الأنسجة الدهنية برفق جانبا للكشف عن الحويصلة المنوية.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط حلقي ، ارفع الحويصلة المنوية بعناية حتى يمكن التعرف على البروستاتا الأمامية. الآن ، مع حقنة أنسولين 0.5 مليلتر وإبرة قياس 30 8 ملليمتر. حقن حجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر من محلول الفيروس في ظهارة البروستاتا الأمامية. قلل من التسرب وتأكد من امتصاص السائل داخل الأنسجة ، مما يشكل فقاعة صغيرة.

ثم ضع الحويصلة المنوية مرة أخرى في تجويف البطن. لضمان امتصاص السائل داخل الأنسجة في فقاعة صغيرة وبدون تسرب ، تأكد من الحقن بالتوازي مع الحويصلة المنوية واتباع شكل فص البروستاتا الأمامي. باستخدام إبرة مستدقة ودائرة 13 ملم 3/8 ، قم بخياطة العجان بغرز متقطعة بسيطة من خياطة قابلة للامتصاص 6-0.

ثم رفع الجلد بالملقط لتجنب إتلاف الصفاق. قم بتدبيس الجلد بثلاثة مشابك معقمة 4.8 × 6.5 ملم. من أجل تعافي أفضل بعد الجراحة ، استخدم حقنة معقمة سعة 1 مليلتر وإبرة قياس 27 × 1/2 بوصة لإدارة ترياق التخدير بجرعة 0.1 مل لكل جرام من وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق. ثم ضع بعناية في قفصه.

احتفظ بالقفص على وسادة تدفئة لمدة ساعة بعد العملية لمنع انخفاض حرارة الجسم حتى يتعافى تماما. يجب أن يستيقظ بعد بضع دقائق من الحقن. استمر في مراقبة وعلاجه يوميا وفقا لبروتوكول النص.

وعندما يغلق الجرح ، قم بإزالة مشابك الجلد. لتقييم توصيل الفيروس إلى البروستاتا الفئران ، تم تحليل العينات بعد ثلاثة أشهر من الجراحة. كما هو موضح هنا ، عبرت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة عن GFP في الخلايا التي تعرضت لبروتين كري الذي يعبر عنه الفيروس.

تظهر إشارة GFP نشاط Cree في ظهارة البروستاتا ولكن ليس ما إذا كان التحرير الجيني قد تم إحداثه بواسطة دليل كريسبر. تحدد هذه الأقسام الكيميائية المناعية المناطق البؤرية للخلايا ذات التعبيرات العالية عن pAKT ، مما يشير إلى فقدان P10. في هذه اللوحات ، حدد costaining ل pAKT و GFP الخلايا الإيجابية المزدوجة ، مما أكد تحول خلايا البروستاتا بواسطة الفيروس المرتبط بالغد.

بشكل عام ، تظهر هذه النتائج أنه في الجسم الحي ، يمكن إجراء تحرير الجينات CRISPR-Cas9 في ظهارة البروستاتا باستخدام فأر Rosa26-LSL-Cas9-EGFP والفيروس المرتبط بالغد. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الإجراء في 15 دقيقة. مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال سرطان البروستاتا لفحص جينات متعددة في وقت واحد في الجسم الحي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل الركيزة إلى البروستاتا الفئرانية. لا تنس أنه عند التعامل مع بعض الفيروسات يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات عند القيام بهذه الإجراءات.