الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك
April 20th, 2018
هنا، نحن نقدم طريقة منخفضة التكلفة وموثوق بها لتوليد اليكتروبوراتيد الدماغ أورجانوتيبيك شريحة الثقافات من أجنة الفأر مناسبة للفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات التصوير العيش.
الهدف العام من هذه التجربة هو تصور الخلايا العصبية الداخلية القشرية المعدلة وراثيا GABAergic أثناء الهجرة العرضية في بيئة طبيعية أكثر ممكنة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم الأعصاب التنموية عن طريق فحص تأثير فقدان وظيفة جينات معينة من البروتينات أثناء نمو الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها منخفضة التكلفة وسهلة الأداء نسبيا مقارنة بالطرق المماثلة الأخرى مثل التثقيب الكهربائي للرحم.
لذلك يمكن لهذه التقنية في النهاية تحسين التشخيص للمرضى الذين يعانون من اضطرابات النمو العصبي الوراثية مثل التوحد والصرع من خلال توضيح التسبب في طفرات معينة تم تحديدها في المرضى بالإضافة إلى أدوار جينات الأمراض الجديدة أثناء نمو الدماغ. ابدأ بإعداد خزانة السلامة الحيوية بجميع الأدوات اللازمة للتشريح والثقافة. رش جميع الأدوات الموجودة في خزانة السلامة الحيوية بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول وتعقيم الأدوات وداخل الخزانة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 إلى 20 دقيقة.
عندما تكون جاهزا لجمع الأجنة ، قم برش بطن السد القتل الرحيم بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول. اسحب جلد البطن لأعلى باستخدام زوج من الملقط المعقم وباستخدام اليد الأخرى ، استخدم مقصا جراحيا معقما لقطع الجلد من البطن. باستخدام زوج ثان من الملقط والمقص المعقم ، اسحب اللفافة البطنية لأعلى واقطعها مع تجنب الرحم بعناية.
باستخدام زوج ثالث من الملقط والمقص المعقم، أمسك قرون الرحم واقطعها من تجويف الحوض. ضع قرون الرحم المقطعة في بتريشيد معقم بحجم 60 ملم مليء بوسط ثقافة ليبوفيتز العصبي المكمل بالأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح غير العضوية. في خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، استخدم زوجين من الملقط الناعم لتشريح الأجنة من المشيمة وعزل الرؤوس عن طريق قطع الرأس.
قمبقطع طرف ماصة نقل بلاستيكية معقمة سعة ثلاثة ملليلتر واستخدمها لشفط الرؤوس ونقلها إلى طبق بتري معقم جديد مقاس 60 ملم مملوء بنفس وسط الثقافة العصبية المكمل لغسل الدم. انقلها مرة أخرى إلى طبق بتري ثالث مغطى بالشمع الأسود المتصلب ومليء بوسط الثقافة المكمل العصبي. ضع طبق بتري مقاس 16 ملم مغطى بالشمع الأسود ويحتوي على الرؤوس المقطوعة الرأس في وسط استزراع مكمل عصبي تحت مجهر التشريح في خزانة السلامة الحيوية.
استخدم ملاقط دقيقة مثبتة في اليد اليسرى لتثبيت الرأس بحيث يكون الجزء المنقاري متجها لليمين. ثم استخدم حاقن النانو في اليد اليمنى لحقن ميكرولتر إلى ميكرولتر من محلول البلازميد المصبوغ بالصبغة في البطين الجانبي الأيمن. قم بتزويد الدماغ المحقون بالكهرباء عن طريق وضع الرأس بين الأقطاب الكهربائية مع وضع القطب السالب ظهريا وموازيا للرأس والقطب الموجب باتجاه الجانب البطني من الرأس لاستهداف MGE.
بمجرد وضع الأقطاب الكهربائية بشكل جيد ، قم بتوصيل نبضات رباعية مربعة من 40 فولت لمدة 50 مللي ثانية على فترات نبضة 500 مللي ثانية. بينما لا تزال تعمل في البيئة المعقمة لخزانة السلامة الحيوية ، ابدأ في تشريح الدماغ من الجمجمة. أولا ، قم بتثبيت الرأس على طبقة الشمع الأسود عن طريق إدخال إبرة في كل عين مع تجنب الدماغ بعناية.
ثم استخدم زوجا من الملقط الناعم لتثبيت الجانب الأيسر من الرقبة وزوجا ثانيا من الملقط الناعم لتمزيق الجلد من الجمجمة من الخلف إلى الأمام. أثناء إمساك الرأس بشكل جانبي باستخدام ملاقط في يد ، استخدم زوجا آخر من الملقط في اليد الأخرى لقطع الجمجمة بعناية على مستوى جذع الدماغ وسحب الجمجمة لأعلى. مع كل ملقط ، قم بقص الجمجمة في المستوى السهمي باتجاه الأمام ثم شق جانبيا لتحرير شظايا الجمجمة.
ثم ارفع جذع الدماغ وقطع السحايا والأعصاب القحفية بعناية حتى يخرج الدماغ تماما من الجمجمة. املأ طبق بتري مقاس 35 ملم بمحلول الاغاروز المنصهر المحفوظ بالسائل عند 42 درجة مئوية. ثم انقل الدماغ الكهربائي بسرعة إلى طبق مملوء بالأغروز باستخدام ماصة النقل المقطوعة مسبقا.
حرك الاغاروز بعصا معدنية لإبقاء الدماغ في منتصف البئر لمنع الغرق ووضع الدماغ في مستوى ذيلية منقاري مواز للطبق. توقف عن التقليب عندما يبدأ الاغاروز في التصلب لتجنب أي ضرر للدماغ. أثناء انتظار تضمين الاغاروز لتصلب ، انقل 750 ميكرولتر من وسط الاستزراع المكمل N2 في كل بئر من لوحة ثقافة الآبار الستة وفقا لعدد الأدمغة المراد معالجتها.
ووضع غشاء 30 ملم في كل وسط مملوء جيدا. استخدم شفرة حلاقة لقطع الاغاروز المحيط بالدماغ لتشكيل كتلة مستطيلة تترك هامشا من ملليمتر إلى ملليمترين حول الدماغ. تأكد من أن الجزء المنقاري من الدماغ عمودي على الحد الأمامي للكتلة لتسهيل التوجيه لخطوات التقسيم اللاحقة.
قم بلصق كتلة الاغاروز على الحافة المنقارية لمنصة الاهتزاز المتجهة لأسفل والحافة البطنية التي تواجه المستخدم. قطع الدماغ في أقسام إكليلية للحصول على أقسام بسمك 250 ميكرون عند أربع درجات مئوية. باستخدام ملاعق معقمة ، اجمع قسمين إلى ثلاثة أقسام تحتوي على MGE وضع جميع أقسام الدماغ من واحد على غشاء واحد 30 ملم.
مع تجنب التداخل بين الأقسام بعناية. ضع لوحة الثقافة في حاضنة معقمة جيدة التهوية عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ و 5٪ CO2 لمدة 48 أو 72 ساعة. بعد وقت الحضانة المطلوب ، انقل الأقسام ذات الأهمية إلى غطاء من ثماني غرف مملوء بثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من وسط الاستزراع.
ضع الغطاء في غرفة بيئية ، وقم بتوصيله بقرص دوار مقلوب متحد البؤر مزود ببرنامج اقتناء بمساعدة الكمبيوتر لإعداد جلسة التصوير بفاصل زمني. يتم رؤية الخلايا العصبية الداخلية المكهربة في E 13.5 مع بلازميد تجريبي يعبر عن كاسيت الطماطم TD و SH RNA الذي يستهدف جينا ذا أهمية في الهجرة العرضية في شريحة دماغية عضوية نموذجية تم الحصول عليها من جنين الفأر DLX5 6Cre RCEE GFP بعد 48 ساعة من الزراعة. تم تصور الخلايا العصبية الداخلية باستخدام التصوير الحي بفاصل زمني لمدة ثماني ساعات.
في هذا المثال ، يظهر نفس الخلايا العصبية الداخلية المثقبة كهربائيا في عملية داء النواة. أثناء الهجرة بشكل عرضي في القشرة بالتوازي مع سطح التقشير. تعرض الخلايا العصبية في البداية جسم خلية ممدود في عملية النيوكليوكينات.
بالإضافة إلى عملية تتبع وعملية قيادة متفرعة. بعد ثلاث ساعات من التصوير المباشر ، يكتمل النيوكليوكينات. تراجعت عملية التتبع والعملية الرائدة تمتد إلى فرعين طويلين.
بعد خمس ساعات و 30 دقيقة ، تراجع أحد فروع العملية الرائدة وتحرك جسم الخلية العصبية إلى الأمام حوالي 10 ميكرون. أخيرا ، بعد ثماني ساعات من التصوير ، توقفت الهجرة مؤقتا ، ومددت الخلايا العصبية عمليتها الرائدة مرة أخرى وظهرت عملية زائدة. لكن النواة لم تتحرك بعد إلى الأمام.
بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على بيئة معقمة في جميع الأوقات الممكنة. لذلك باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التثقيب الكهربائي MG متبوعا بالنماذج الخارجية لمعالجة أسئلة إضافية للحصول على إجابات لتوضيح عمليات الهيكل الخلوي الديناميكي التي تحدث أثناء الهجرة العصبية على مستوى الخلايا فوق الخلية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنية منخفضة التكلفة وفعالة لتوليد ثقافات شرائح دماغية نمطية منفذة من أجنة الفئران، مما يمكن من تصوير الخلايا العصبية الداخلية GABAergic المعدلة وراثيًا خلال هجرتها العرضية. تهدف الطريقة إلى التحقيق في تأثيرات طفرات جينية محددة على نمو الدماغ، مما يوفر رؤى محتملة حول اضطرابات النمو العصبي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء النمائي
- علم الوراثة العصبية
الخلفية
- فهم هجرة الخلايا العصبية الداخلية GABAergic ضروري لعلم الأعصاب النمائي.
- فقدان وظيفة الجينات أثناء نمو الدماغ يثير أسئلة حول اضطرابات النمو العصبي.
- التقنيات منخفضة التكلفة يمكن أن تعزز القدرات التشخيصية لاضطرابات مثل التوحد والصرع.
- تسمح طرق الكهربائي بمعالجة معدلة مستهدفة للتعبير الجيني في الجسم الحي.
غرض الدراسة
- لتصور هجرة وسلوك الخلايا العصبية الداخلية GABAergic المعدلة وراثيًا في البيئات الثقافية.
- لتحديد تأثيرات طفرات الجينات على تطور الخلايا العصبية.
- لتطوير طريقة أكثر سهولة لدراسة علم الأعصاب النمائي.
الطرق المستخدمة
- تستخدم الطريقة ثقافات شرائح نمطية مشتقة من أجنة الفئران.
- يتضمن النموذج البيولوجي الخلايا العصبية الداخلية GABAergic القشرية، مع التركيز تحديدًا على هجرتها.
- يستخدم الكهربائي لإدخال محاليل البلازميد في الدماغ النامي.
- تشمل الخطوات الرئيسية تشريح الجنين بعناية، والكهربائي، وإعداد الثقافة للتصوير.
- يتم توقيت ومراقبة الحضانة والتشذيب للتصوير بشكل حاسم.
النتائج الرئيسية
- تُمكّن الدراسة من ملاحظة أنماط الهجرة الداخلية للخلايا العصبية الداخلية GABAergic.
- قد توضح الرؤى المكتسبة تأثيرات الطفرات على العمليات النمائية.
- الظروف الميكانيكية والبيئية أثناء التشريح والثقافة تؤثر بشكل كبير على القابلية للحياة والملاحظة.
- ستساعد النتائج في توضيح الآليات الكامنة وراء اضطرابات النمو العصبي.
الاستنتاجات
- توفر هذه التقنية منصة موثوقة لدراسة هجرة الخلايا العصبية ووظيفة الجينات.
- تقف الطريقة لتعزيز فهم التأثيرات الوراثية على نمو الدماغ.
- قد تعزز الرؤى المكتسبة منهجيات علاج اضطرابات النمو العصبي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to study GABAergic interneuron migration in a near-physiological context, supporting target validation for neurodevelopmental disorders. By combining ex utero electroporation with organotypic slice cultures, it provides a scalable platform for mechanistic de-risking of gene candidates linked to autism and epilepsy. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic manipulation to dynamic cellular phenotypes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in migrating GABAergic interneurons to clarify pathogenic mechanisms of neurodevelopmental disorder mutations.
- Operational Value: Supports high-confidence target selection by linking genetic perturbation to quantifiable migration phenotypes in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative live-imaging readouts of nucleokinesis, process dynamics, and migration speed for assay standardization.
- Operational Value: Enables reproducible, time-lapse confocal imaging of interneuron behavior across genetic conditions for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains endogenous guidance cues and thalamic inputs, improving translational relevance of migration phenotypes observed in cortical slices.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene targeting in embryonic brain to phenotypic analysis in organotypic culture for preclinical de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling gene function screening in migrating interneurons prior to lead identification, supporting go/no-go decisions based on migration defect severity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene roles in interneuron migration through direct visualization of cytoskeletal dynamics and nucleokinesis.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved phenotypic outputs such as migration distance, branching, and pausing for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides morphometric and kinetic measurements from time-lapse imaging and neuronal reconstructions to enable statistical comparison of genetic perturbations.
- Translational Research: Preserves endogenous cortical environment and migratory pathways, enhancing relevance of findings to human neurodevelopmental disorder models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of gene candidates across multiple neurodevelopmental disorder targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking gene loss-of-function to specific migration defects in GABAergic interneurons.
- Operational Value: Offers a low-cost, standardized alternative to in utero electroporation with improved embryo survival and sectioning consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through phenotypic screening in a disease-relevant system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene targets based on severity and specificity of migration phenotypes observed.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, ventricular injection, and electroporation parameters for MGE targeting.
- Depends on sterile technique, agarose embedding precision, and vibratory sectioning at 4°C to maintain tissue integrity.
- Necessitates environmental control during culture (37°C, 60% humidity, 5% CO2) and confocal imaging setup for time-lapse acquisition.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require adjustments to electroporation orientation and culture duration.
- Practical limitations include dependency on embryo viability post-electroporation and section quality for consistent imaging of migrating interneurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Collection of Mouse Embryos
2:51
Intraventricular Plasmid Injections and Ex Vivo Electroporation of the MGE
3:53
Brain Dissection and Organotypic Slice Cultures
7:16
Results: Time-lapse Live-imaging of Electroporated INs in Organotypic Slices Cultured for 48 h.
9:09
Conclusion
