تقييم إدراج إكسون الناجمين عن طريق لصق تبديل النوكليوتيد العقاقير في SMA المريض الليفية

الهدف العام من بروتوكول نقل الدهون هذا هو إدخال قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى في الخلايا وتقييم فعالية هذه الأدوية على إدراج الإكسون في خلايا SMA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج المضاد للحساسات. مثل فعالية oligos antisense الجديدة لتوفير العلاج للمرضى.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار العديد من كيمياء قليل النوكليوتيدات المضادة للحساس. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتعدين oligos antisense إلى الخلايا الليفية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا العضلية الأولية وخطوط الخلايا الأخرى المختلفة. سيوضح الإجراء أليكس ، فني من مختبري.

أولا ، قم بإذابة محلول 10 ميكرومولار من خلاط LNA / DNA على الجليد. قم بتخفيف محلول الخلاط في الوسائط المحرومة من المصل إلى التركيز المطلوب في أنبوب سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، قم بتخفيف كاشف الإرسال وإضافة كاشف التعداء المخفف إلى الخلاط بنسبة واحد إلى واحد.

من الأهمية بمكان أن يكون التقاء الخلية حوالي 65 إلى 80٪ أثناء القيام بالتعدين. إذا كان التقاء أكثر من 80٪ ، تقليل كفاءة التعداد. ثم احتضان خليط كاشف النفقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد 10 دقائق ، يتم وضع 900 ميكرولتر من الوسط المحروم من المصل مع مصل بقري الجنين بنسبة 5٪ إلى الأنبوب. لا تقم بإضافة FBS قبل الحضانة باستخدام كاشف التعدي وخلاطات LNA / DNA ، لأنها تؤثر أيضا على كفاءة التعداد. ثم استنشق الوسط القديم من لوحة الثقافة.

الآن ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط الذي يحتوي على خلاط LNA / DNA إلى لوحة الاستزراع. ثم اترك الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. بعد الحضانة ، استنشق الوسط من لوحة الثقافة.

ثم ، قم بسحب مليلتر واحد من كاشف GPC إلى الخلايا. بعد ذلك ، اغسل الآبار عدة مرات باستخدام كاشف GPC. بعد عدة غسلات ، اجمع الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل واحتفظ بالعينات على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب بسرعة عالية لمدة 30 ثانية. ثم قم بتخزين الأنبوب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة. الآن ، قم بإذابة العينة في درجة حرارة الغرفة وقم بدوامها بسرعة.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة ورجها بقوة لمدة 15 ثانية. ثم احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. بعد ثلاث دقائق ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 12،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، اجمع الطور المائي من أعلى أنبوب الطرد المركزي. ثم انقل المرحلة المائية في أنبوب جديد. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول وميكرولتر واحد من ثمانية ميكروغرام لكل ميكرولتر من الجليكوجين من درجة الحمض النووي الريبي إلى المرحلة المائية.

بدوامة العينة بسرعة لمدة 10 ثوان واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 12 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. صب الطاف بعد انتهاء الجري.

أضف ملليلتر واحد من الإيثانول البارد 75٪ والدوامة لفترة وجيزة لغسل الحبيبات التي تم الحصول عليها. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 7500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم طرد كل الإيثانول وجفف الحبيبات في درجة حرارة الغرفة.

بعد أن تجف الحبيبات ، قم بإذابتها في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من DNAse / RNAse. ثم احتضان العينة عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اقرأ تركيز الحمض النووي الريبي عند 260 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي واضبطه على 15 نانوجرام لكل ميكرولتر.

لتشكيل المزيج الرئيسي RT-PCR ، أضف المخزن المؤقت لتفاعل X RT-PCR ، ومزيج إنزيم RT-PCR بخطوة واحدة ، والبادئات الأمامية والعكسية والماء المقطر الخالي من RNAse / DNAse. قم بتوزيع المزيج الرئيسي إلى أنابيب PCR 0.2 ملم وأضف إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة معنية. ثم ابدأ تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

بعد اكتمال RT-PCR ، أضف خمسة ميكرولترات من صبغة التحميل ستة X إلى المنتج المضخم. ثم قم بتحميل خمسة ميكرولترات من الخليط على جل الاغاروز بنسبة 2٪. ابدأ وحدة الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة 40 دقيقة.

أولا ، تتم دراسة كفاءة الخلاطات المختلفة. للقيام بذلك ، يتم تحليل إدراج مستويات SMN2 exon 7 و GAPDH في الخلايا الليفية SMA المنقولة باستخدام الخلاطات. تظهر صورة الهلام إدراج exon 7 حيث يمثل النطاقان العلوي والسفلي exon 7 المتضمن والمستبعد SMN2 RNA.

يتم أيضا تحديد كفاءة التضمين لتكون من 78 إلى 98٪ عند نقلها باستخدام الخلاطات من واحد إلى خمسة. من ناحية أخرى ، لا يتم الحصول على نتائج مهمة عند استخدام الخلاط من ستة إلى ثمانية لنقل الخلايا الليفية SMA للمريض مقارنة بعنصر التحكم. في التجربة ، يتم استخدام GAPDH كعنصر تحكم.

بعد ذلك ، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتحليل التعبير النسبي ل SMN2 كامل الطول مقارنة ب GAPDH. لوحظت زيادة حادة في كمية مستوى نسخ SMN2 عند نقلها باستخدام الخلاطات من واحد إلى ثلاثة ورقم خمسة ، مقارنة بعنصر التحكم. تمت دراسة مستوى تعبير بروتين SMN أيضا ، مما يدل على زيادة في مستوى تعبير بروتين SMN في الخلايا الليفية للمريض المنقولة بالخلاطات من واحد إلى خمسة.

لوحظت زيادة حادة من 1.5 إلى 1.9 مرة في مستوى بروتين SMN. هنا ، عنصر التحكم المستخدم هو الكوفيلين. على العكس من ذلك ، لا يغير الخلاط من ستة إلى ثمانية مستوى تعبير بروتين SMN.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل oligo antisense إلى الخلايا الليفية وتقييم فعاليتها في المختبر.