متجانسة فورستر حل وقت الرنين الطاقة القائم على نقل التحليل للكشف عن إفراز الأنسولين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز مستويات الأنسولين المفرز من الخلايا التي تفرز الأنسولين وتحديدها بدقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السكري ، مثل الآليات الرئيسية تحت إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز في خلايا بيتا البنكرياس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تحدد بدقة وسرعة إفراز الأنسولين استجابة لتحفيز الجلوكوز واكتشاف تأثيرات الدواء المحتملة على الإفراز.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج واكتشاف الأدوية لعلاج مرض السكري من النوع 2 ، لأنها ستسمح لنا بفهم آليات الخلل الأيضي الناجم عن الأدوية بشكل أفضل. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لإفراز الأنسولين من خطوط خلايا بيتا الخالدة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل جزر البنكرياس السليمة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، بسبب خطوات التعامل مع الخلايا المتعددة ومستحضرات المخدرات.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا التوصل إلى اختبار سريع للتحقيق في تصرفات عقاقير الدوبامين على إفراز الأنسولين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات التعامل مع الخلايا بسبب الطبيعة الدقيقة للخلايا وأهمية الدقة لضمان اتساق الفحص بين التجارب. أولا ، قم بتنمية خلايا INS-1E كما هو موضح في بروتوكول النص.

بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء المطلوب ، استنشق الوسط. اغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من 025٪ تريبسين إلى الخلايا ثم اترك الخلايا في الحاضنة لمدة ثلاث إلى أربع دقائق عند 37 درجة مئوية.

قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة تسعة ملليلتر من الوسط الكامل. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. ثم الطرد المركزي الخلايا لتشكيل حبيبات.

بعد الطرد المركزي ، قم بإذابة الحبيبات في خمسة ملليلتر من الوسط الطازج. تخرج الماصة 10 ميكرولترات من الخلايا المعاد تعليقها من الأنبوب وتخلط مع 10 ميكرولترات من الصبغة الحيوية الزرقاء لتقييم الجدوى. بعد ذلك ، استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا الحية والميتة والتأكد من أن 90٪ من الخلايا حية.

بعد العد ، أضف مليون خلية لكل مليلتر في وسط RPMI 1640 الطازج ، ثم قم ببذور 0.5 مل من 500 ، 000 خلية INS-1E في كل بئر من صفيحة 24 بئرا مطلية ب poly-L-lysine. اترك الطبق في الحاضنة ليوم كامل. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسائط وأضف 500 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الطازج في كل بئر.

احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة أخرى حتى تنتشر الخلايا على أسطح البئر. لإجراء الفحص ، قم أولا بإعداد المخزن المؤقت KRB ، ثم استنشق الوسط من كل بئر واغسله بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المسخن مسبقا مرتين. بعد ذلك ، أضف 450 ميكرولترا من المخزن المؤقت KRB ، مع استكمال ألبومين مصل الأبقار ، ولكن بدون جلوكوز ، في كل بئر.

اترك لوحة الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. تحضير التخفيفات التسلسلية للأدوية في المخزن المؤقت KRB ، مع استكمال التركيز النهائي 10X من 200 مللي مولار جلوكوز. بعد خطوة تجويع الجلوكوز ، قم بتعبئة 50 ميكرولترا من الأدوية المخففة بشكل متسلسل في كل من الآبار المقابلة.

لتحفيز الجلوكوز ، أضف الأدوية المخففة بشكل متسلسل في وجود 20 مللي مولار من الجلوكوز. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بمجرد انتهاء التحفيز ، اجمع المواد الطافية وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.

انقل 10 ميكرولترات من كل مادة طافية مجمعة إلى طبق مكون من 96 بئرا. أضف 90 ميكرولترا من KRB إلى كل بئر لتحقيق نسبة تخفيف من واحد إلى 10. امزج التخفيفات لضمان التجانس.

بعد ذلك ، احصل على منحنى الأنسولين القياسي لمقايسة الأنسولين HTRF. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر لكل من عينات الأنسولين القياسية والمواد الطافية المخففة إلى لوحة 96 بئرا. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة في متبرع واحد إلى اثنين لقبول نسبة في المخزن المؤقت للكشف.

بعد تحضير مزيج الأجسام المضادة ، أضف 30 ميكرولترا منه إلى كل بئر في طبق 96 بئرا. أغلق اللوحة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعتين من الحضانة ، اقرأ اللوحة مع مزيج الجسم المضاد على قارئ اللوحة.

استخدم الوحدة البصرية HTRF المناسبة عند 665 و 620 نانومتر للقراءة واستخدم 200 ومضة لكل بئر. أولا ، يتم رسم منحنى معيار الأنسولين لاستقراء القيم الفعلية للأنسولين من عينات الفحص. يوضح المنحنى القياسي أن قراءة التألق النسبي التي تم الحصول عليها تزداد بشكل كبير كدالة لتركيزات الأنسولين البشري القياسية المحددة مسبقا.

بعد ذلك ، تتم دراسة المستوى الأساسي لإفراز الأنسولين من خلايا INS-1E في وجود أو عدم وجود 20 مللي مولار من الجلوكوز. من المؤامرة ، يظهر أن الخلايا تفرز ما يقرب من 100 نانوجرام لكل مليلتر من الأنسولين في وجود الجلوكوز. ومن المثير للاهتمام أن مستوى الأنسولين يبلغ النصف تقريبا عند حوالي 15 نانوغرام لكل مليلتر في حالة عدم وجود الجلوكوز.

بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا في وجود تركيزات متزايدة من الدوبامين مع 20 مللي مولار. يتم تطبيع الأنسولين الذي يفرز إلى متوسط قيمة النسبة المئوية القصوى للأنسولين من كل بئر. تظهر المؤامرة أن الدوبامين يثبط GSIS ، مما يشير إلى الأهمية الوظيفية لمستقبلات الدوبامين في GSIS.

توضح هذه المؤامرة أن بروموكريبتين ، وهو دواء لمرض السكري من النوع 2 ، أكثر فعالية في إحداث GSIS من الدوبامين. توضح هذه المؤامرات أنه مع زيادة تركيز quinpirole ، يظهر ناهض D2 ، على الرغم من أنه أقل كفاءة من البروموكريبتين ، فاعلية مماثلة مثل الدوبامين في تحفيز GSIS. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام الماصة بعناية وباستمرار. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات وظيفية أخرى مثل مقايسة AMP HDRF الدورية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تأثيرات دواء الدوبامين على الإشارات النهائية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التمثيل الغذائي لاستكشاف مسارات إفراز الغدد الصماء الأخرى في كل من خطوط الخلايا الخالدة وجزر البنكرياس.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس إفراز الأنسولين بدقة من الخلايا باستخدام HDRF.