تحديد مواقع النسخ Olig2 عامل ربط الجينوم في حدة تنقية PDGFRα + الخلايا من الكروماتين خلية منخفض إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل التحليل

الهدف العام من هذه التجربة هو تحليل الارتباط على مستوى الجينوم لعامل نسخ الخلايا قليلة التغصن الثاني في الخلايا السليفة للخلايا قليلة التغصن في الدماغ النقية بشكل حاد عن طريق إجراء الترسيب المناعي للكروماتين منخفض الخلية ، والتسلسل عالي الإنتاجية ، وتحليل البيانات المعلوماتية الحيوية. هذه الطريقة هي أداة قوية لدراسة تنظيم النسخ على مستوى الجينوم والآليات اللاجينية ، والتي تلعب أدوارا مهمة في تمايز الخلايا وتطورها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتطبيق على نطاق واسع في ChIP-seq لعوامل النسخ الأخرى مع أي نوع من الخلايا بأعداد محدودة ، بما في ذلك الخلايا الأولية النقية بشكل حاد دون تكاثر في المختبر.

توضيح الإجراء Yanan You ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. وهي مؤلفة مشاركة لهذه الورقة. لتحديد الخلايا الإيجابية PDGFR-alpha ، قم بإعداد لوحة واحدة للمناعة.

قم بإعداد طبقتين أخريين للخلايا البطانية واستنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة. ثم قم بتغطية طبق بتري بطول 10 سم ب 30 ميكرولترا من الغلوبولين المناعي المضاد للفئران. بعد ذلك ، قم بتحريك اللوحة للتأكد من أن سطح اللوحة بالكامل مغطى بالتساوي بمحلول الطلاء.

اترك طبق بتري طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتخفيف 40 ميكرولترا من الجسم المضاد للفئران المضاد ل PDGFR-alpha مع 12 مل من DPBS يحتوي على 0.2٪ ألبومين مصل البقر. بعد ذلك ، اغسل الصفيحة المطلية بالغلوبولين المناعي G ب 10 ملليلتر من 1X DPBS لثلاث مرات متتالية.

بعد ذلك ، قم باحتضان الصفيحة المطلية بالغلوبولين المناعي G بمحلول الأجسام المضادة PDGFR-alpha في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات. بعد أربع ساعات ، أضف DPBS بعناية على طول الجدار الجانبي للوحة لغسل اللوحة المطلية بالأجسام المضادة PDGFR-alpha للفئران ثلاث مرات. لا تزعج السطح المطلي للوحة.

بعد ذلك ، استخدم 20 مل من DPBS مع 2.3 ميكروغرام لكل مليلتر من BSL-1 لتغطية لوحين بتري بطول 15 سم لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، أضف بعناية 20 مل من DPBS على طول الجدار الجانبي للوحة لغسل لوحة BSL-1 ثلاث مرات. لا تزعج السطح المطلي.

بعد الغسيل ، قم بالطرد المركزي لنظام التعليق أحادي الخلية عند 300 مرة جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، أضف 15 مل من المخزن المؤقت المناعي إلى حبيبات الخلية. بعد ذلك ، قم باحتضان المعلقات أحادية الخلية من دماغين للفأر بالتتابع على طبقين من أطباق بتري المغلفة ب BSL-1.

ثم اترك الأطباق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حرك الطبق كل خمس دقائق أثناء الحضانة. بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة برفق لجمع جميع الخلايا غير الملتصقة من تعليق الخلية.

بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا الموجودة على لوحة الأجسام المضادة PDGFR-alpha المغلفة بالأجسام المضادة. احتضن الطبق لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية 45 دقيقة ، قم بتدوير اللوحة مرة أخرى.

ثم تجاهل تعليق الخلية. بعد ذلك ، اشطف الطبق باستخدام DPBS لمدة ثماني مرات لإزالة الخلايا غير الملتصقة. افحص اللوحة تحت المجهر.

بعد ذلك ، أضف محلول انفصال الخلية على لوحة الأجسام المضادة PDGFR-alpha المغلفة بالجسم. ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في غضون ذلك ، هز اللوحة لإخراج الخلايا الملتصقة ، وفحصها تحت المجهر.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 مرة جم في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية بملليلتر واحد من وسط ثقافة الخلايا OPC. بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق في مقياس كثافة الدم.

بعد العد في مقياس الدم ، أضف 20،000 OPCs المنقى في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا OPC لتفاعل ChIP. ثم أضف 27 ميكرولترا من 36.5٪ من الفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى إصلاح الخلايا.

بعد 10 دقائق ، أضف 50 ميكرولترا من 2.5 مولار جلايسين على الخلايا الثابتة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ستؤدي إضافة الجلايسين إلى إيقاف الارتباط المتبادل بين البروتين والحمض النووي. بعد ذلك ، اغسل الخلايا المتشابكة بمليلتر واحد من المخزن المؤقت HBSS باستخدام كوكتيل مثبط للبروتين.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا في آلة الطرد المركزي المبردة مسبقا عند 300 مرة جم عند أربع درجات مئوية. بعد الربط المتبادل ل OPCs المنقاة ، يجب غسل الخلايا المتشابكة باستخدام محلول HBSS المثلج ، ويجب تنفيذ خطوات ChIP المتبقية عند أربع درجات ، وإلا فلن يتمكن الجسم المضاد من ترسيب الحمض النووي الجيني بشكل صحيح. ثم أضف 25 ميكرولترا من محلول التحلل الكامل إلى حبيبات الخلية ، واتركه على الجليد لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتعبئة ماصة 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBSS المثلج مع كوكتيل مثبط للبروتين. بعد ذلك ، قم بقص كروماتين الخلية في نظام صوتنة مبرد مسبقا مع خمس دورات من 30 ثانية تشغيل و 30 ثانية من البرنامج. بمجرد قص الكروماتين ، قم بعمل طرد مركزي لتحلل الخلية عند 14،000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

في نهاية الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم بحجم متساو من المخزن المؤقت ChIP المثلج البارد مع مثبط البروتين. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحدا من الجسم المضاد للأرانب المضاد ل Olig2 إلى 180 ميكرولتر من الكروماتين المخفف المنفصم.

احتضان الأنابيب على عجلة دوارة لمدة 16 ساعة عند أربع درجات مئوية بمعدل 40 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من حبات البروتين المطلية بالبروتين المغسولة مسبقا إلى أنبوب تفاعل ChIP في غرفة باردة. مرة أخرى ، احتضن أنابيب ChIP عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين أخريين على العجلة الدوارة.

بعد ساعتين ، اترك أنبوب تفاعل ChIP على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة. بعد ذلك ، اغسل حبيبات الخرزة ب 100 ميكرولتر من أربعة مخازن غسيل لكل منها لمدة أربع دقائق على عجلة دوارة عند أربع درجات مئوية. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى حبيبات الخرزة.

احتضان أنبوب التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بمجرد تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الشريطة ، قم بإزالة الفوسفورة من الطرف ثلاثي الرئيسيين للحمض النووي أحادي الخيط عن طريق إضافة فوسفاتيز الجمبري القلوي. بعد ذلك ، أضف ذيل poly-T إلى الحمض النووي أحادي الشريطة باستخدام ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي.

بعد ذلك ، قم بتلدين التمهيدي poly-dA للحمض النووي إلى قالب الحمض النووي أحادي الشريطة. بعد ذلك ، قم بتضخيم مكتبة تسلسل ChIP باستخدام الاشعال الأمامية والخلفية للفهرسة. يعتمد عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل لإعداد المكتبة على مقدار الحمض النووي الأولي.

يتطلب الإعداد الجيد للمكتبة تقديرا كميا دقيقا لكمية الحمض النووي للإدخال. يمكن أن تؤثر دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعددة جدا أو القليلة جدا على تركيز المكتبة ، فضلا عن التعقيد ، مما يؤدي إلى القطع الأثرية ل PCR. استخدم الخرز المغناطيسي لتحديد الأجزاء التي تتراوح من 250 إلى 500 زوج أساسي من مكتبة تسلسل ChIP المضخمة ب PCR.

استخدم جهاز الرحلان الكهربائي للرقاقة الشعرية الموائع الدقيقة لفحص جودة مكتبة تسلسل ChIP المحددة. لتقييم نقاء OPCs المناعية ، يتم إجراء دراسات التلوين المناعي. عند استخدام الجسم المضاد NG2 لعلامة سلالة OPC ، فإنه يظهر أن غالبية الخلايا المناعية للأجسام المضادة PDGFR-alpha إيجابية ل NG2.

بعد ذلك ، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للتحقق من إثراء PDGFR-alpha. تظهر المؤامرة التي تم الحصول عليها القليل من التعبير عن Tuj1 ، وهي علامة عصبية تشير إلى إثراء كبير ل PDGFR-alpha مقارنة بخلايا الدماغ المنفصلة. تم الحصول على نتائج مماثلة تظهر القليل من التعبير عن جميع العلامات الأخرى ، مثل GFAP و Mog و Mbp ، مما يشير إلى إثراء PDGFR-alpha.

بعد ذلك ، يتم تحليل جودة مكتبة تسلسل ChIP. يمثل مخطط الكهربية ذروة واضحة لعامل نسخ Olig2 يتراوح من 250 إلى 500 زوج أساسي بعد اختيار حجم منتج PCR للمكتبة. هنا ، يعرض الرسم البياني استنساخ العلامة ، للتحقق من مقاييس مراقبة الجودة التي تم الحصول عليها قبل استدعاء الذروة.

يشير الشريط إلى أن أكثر من 90٪ من القراءات يتم تعيينها إلى موقع جيني واحد فقط. بعد ذلك ، يتم الحصول على مخطط ارتباط الخيط ، والذي يصور ذروة غنية تتوافق مع طول الجزء السائد. في المخطط ، تمثل الخطوط الحمراء طول القراءة عند 50 زوجا أساسيا وطول الجزء عند 130 زوجا أساسيا ، على التوالي ، مما يشير إلى بيانات عالية الجودة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف موقع ربط الحمض النووي على مستوى الجينوم لعوامل النسخ والبروتينات الأخرى في الخلايا الأولية أو الخلايا النادرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية OPCs الأولية من دماغ الفأر عن طريق التمثيل المناعي وكيفية إجراء تجربة ChIP-seq باستخدام عدد قليل من الخلايا.