تسجيل وتعديل النشاط صرعية في الدماغ القوارض شرائح بالإضافة إلى صفائف ميكروليكترودي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التعديل العصبي لعلاج الصرع ، مثل منطقة الدماغ وبروتوكول التحفيز الأنسب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن شرائح دماغ القوارض تمثل نموذجا مبسطا وواقعيا لدوائر الدماغ بينما تسمح مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة بنقطة مراقبة متعددة على مسافة معروفة بين الأقطاب الكهربائية. لتحضير MEA ، انشر مانع التسرب المرن بالتساوي على السطح السفلي لغرفة التسجيل ، وتأكد من عدم وجود فقاعات.

بعد ذلك ، قم بتركيب غرفة التسجيل على MEA بمساعدة ملاقط ، واضغط برفق. انشر طبقة مانعة للتسرب حول الحدود الخارجية لغرفة التسجيل. بعد ذلك ، ضع مجموعة MEA / الغرفة في بيئة مغلقة ورطبة ، واتركها تشف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

لتحضير مقعد التسجيل ، اضبط الحمام الدافئ على 32 درجة مئوية. بعد ذلك ، اسكب ACSF في غرف التثبيت والتسخين المسبق. قم بغلي المحاليل بخليط 95٪ من الأكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، وقم بإزالة أي فقاعات محاصرة باستخدام ماصة باستور المقلوبة.

احتفظ بغرفة الاحتجاز في درجة حرارة الغرفة ، وضع غرفة التسخين المسبق في الحمام الدافئ. قم بإعداد شرائح دماغ الحصين والقشرة الأفقية وفقا للإجراءات القياسية ، واتركها تتعافى في غرفة الاحتجاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة على الأقل. صب 4AP ACSF في غرفة حضانة.

بعد ذلك ، قم بفقاعاتها بخليط 95٪ من الأكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، وقم بإزالة أي فقاعات محاصرة باستخدام ماصة باستور المقلوبة. بعد ذلك ، قم بتغطية الغرفة وانقلها إلى الحمام الدافئ. تأكد من أن درجات حرارة ACSF قبل الاحترار و 4AP ACSF تتراوح من 30 إلى 32 درجة مئوية.

استخدم ماصة باستور زجاجية مقلوبة لنقل شريحة واحدة من الدماغ إلى حجرة التسخين المسبق، واترك الأنسجة ترتاح لمدة 25 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، انقل شريحة الدماغ إلى غرفة الحضانة 4AP ACSF ، واتركها ترتاح لمدة 60 دقيقة. دع 4AP ACSF يتدفق عبر أنبوب التروية إلى دورق حتى لا يكون هناك هواء بالداخل.

ثم أوقف تدفق المحلول. ضع شريحة MEA الجافة داخل مضخم الصوت MEA ، وقم بتأمين رأس مكبر الصوت. بعد ذلك، استخدم ماصة باستور بلاستيكية لنقل 4AP ACSF إلى خزان مدخل ومخرج غرفة التسجيل.

قم بتثبيت قنية التسخين بحامل مغناطيسي ، وضع طرفها داخل منفذ مدخل غرفة التسجيل. بعد ذلك ، قم بتوصيل الحامل المغناطيسي بشريط مغناطيسي على رأس مضخم MEA. قم بتوصيل أنبوب التروية بالقنية والقنية بمنظم الحرارة.

بعد ذلك ، ضع إبرة الشفط في خزان المخرج. تحقق من وجود ضغط سلبي عن طريق غمر إبرة الشفط في ACSF ، وتحقق من وجود ضوضاء شفط ثابتة منخفضة التردد. بعد ذلك ، اضبط منظم التدفق للسماح بمعدل تدفق يبلغ مليلتر واحد في الدقيقة ، وابدأ في التهريد.

بمجرد تدفق 4AP ACSF عبر القنية ، قم بتشغيل منظم الحرارة. اضبط قنية التسخين على 37 درجة مئوية وقاعدة MEA على 32 درجة مئوية لتحقيق درجة حرارة من 32 إلى 34 درجة مئوية داخل غرفة التسجيل. بعد ذلك ، ضع القطب المرجعي الخارجي في خزان مدخل غرفة التسجيل.

بمجرد استقرار مستوى 4AP ACSF ودرجة حرارة التسجيل حسب الرغبة ، قم بتحويل التروية ومحبس الشفط إلى وضع إيقاف التشغيل لإيقافهما مؤقتا. انقل شريحة دماغ واحدة بسرعة إلى غرفة تسجيل MEA باستخدام ماصة باستور زجاجية مقلوبة. اضبط موضعها على منطقة التسجيل في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا حسب الحاجة باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار أو فرشاة صغيرة ناعمة ومضغوطة.

ضع مرساة التثبيت على شريحة الدماغ. أعد تشغيل التروية والشفط عن طريق إعادة محبس التثبيت إلى وضع التشغيل. التقط صورة لشريحة الدماغ باستخدام كاميرا مثبتة على مسرح مجهر مقلوب.

بعد ذلك ، قم بتشغيل البرنامج النصي mapMEA على برنامج الكمبيوتر لبدء واجهة المستخدم الرسومية لتعيين الأقطاب الكهربائية. انقر على تصفح زر لتحميل صورة شريحة الدماغ. تأكد من ظهور القطب المرجعي في العمود العلوي من الجانب النصف الأيسر من MEA.

ثم انقر فوق تنشيط المؤشر زر. حدد الأقطاب العلوية والسفلية في العمود الموجود في أقصى يسار المصفوفة لتمييز إحداثيات XY لاستقامة الصورة وتعيين القطب. من القائمة المنسدلة نوع الشريحة، حدد أفقي.

ضع علامة في خانة الاختيار الهياكل الافتراضية. باستخدام أزرار الضغط المرقمة أسفل صورة شريحة الدماغ ، حدد الأقطاب الكهربائية المقابلة لعائد الاستثمار ، وانقر فوق أزرار الضغط المقابلة في لوحة الهيكل لتعيينها. كرر هذه الخطوة لكل عائد استثمار.

بعد ذلك ، اضغط على حفظ زر. سيقوم البرنامج بإنشاء مجلد نتائج يحتوي على جدول يبلغ عن الأقطاب الكهربائية المحددة وعائد الاستثمار. لدراسة الفيزيولوجيا الكهربية ، قم بتشغيل وحدة التحفيز قبل 10 دقائق على الأقل من بروتوكول التحفيز للسماح بالمعايرة الذاتية والثبات.

بعد ذلك ، ابدأ تشغيل برنامج التحكم في التحفيز ، وتحقق من توصيل المحفز ومضخم MEA بشكل صحيح ، كما هو موضح بمؤشر LED أخضر في اللوحة الرئيسية لبرنامج التحكم في التحفيز. قم بإعداد التحفيز في تكوين ثنائي القطب. قم بتوصيل وحدة التحفيز بالأرض.

بعد ذلك ، قم بتوصيل أزواج الأقطاب الكهربائية الملامسة لطبقة الخلية الهرمية ل CA1 / subiculum القريب من بين تلك التي تم تعيينها باستخدام البرنامج النصي mapMEA. للحصول على البيانات ، اضغط على زر التشغيل في اللوحة الرئيسية لبرنامج التسجيل. سجل ما لا يقل عن أربع إفرازات من الجلد.

بعد ذلك ، قم بإجراء اختبار إدخال / إخراج سريع لتحديد أفضل شدة تحفيز. للقيام بذلك ، استخدم اللوحة الرئيسية لتصميم نبضة تيار موجبة سالبة مربعة ثنائية الطور بمدة 100 ميكروثانية لكل مرحلة. في علامة تبويب اتساع النبضة ، أدخل سعة نبضة أولية تبلغ 100 ميكرو أمبير لكل مرحلة.

اضبط نبضة التحفيز على 0.2 هرتز أو أقل عن طريق إضافة فاصل زمني بين النبضات مدته خمس ثوان أو أكثر. قم بزيادة سعة التحفيز بمقدار 50 إلى 100 خطوة ميكروأمبير في كل تجربة حتى يمكن للتحفيز أن يستحضر بشكل موثوق أحداثا شبيهة بالخلايا البينية في القشرة المجاورة للحصين. للتعديل الكهربائي لتكوين الإيكوتوجين الحوفي ، قم ببرمجة وحدة التحفيز لتقديم بروتوكول التحفيز محل الاهتمام ، واستخدم سعة التحفيز المحددة أثناء اختبار الإدخال / الإخراج.

بعد توقف التحفيز ، تحقق من استعادة الشبكة إلى حالة ما قبل التحفيز عن طريق تسجيل ما لا يقل عن أربعة تصريفات ictal. يوضح هذا الشكل تسجيلات نشاط العنف الجليدي الناجم عن 4AP في القشرة المخية الداخلية والقشرة المحيطة بالأنف أثناء حالة التحكم ، والإيقاع الدوري عند هرتز واحد ، وأثناء التعافي عند انسحاب التحفيز. يوضح هذا الرسم البياني القياس الكمي لتأثير السرعة الدورية عند هرتز واحد ، مما يشير إلى انخفاض كبير في إجمالي وقت الاستيلاء أثناء التحفيز.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر وضع شريحة الدماغ بسرعة وبشكل صحيح على MEA. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلاعب الدوائي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول مساهمة الناقلات العصبية أو القناة الأيونية في نشاط الصرع وتأثير التعديل العصبي.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف تفاعل الشبكة العصبية في الصحة والمرض في الخلايا العصبية المستنبتة وكذلك في شرائح الدماغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل وتعديل نشاط الصرع الناجم عن أربعة أمينوبيريدين في شرائح دماغ القوارض المقترنة ب MEAs.