بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

الهدف العام من هذا الفيديو هو توضيح طريقة الاستدعاء الجلدي لفطة الشفط التي تسمح لنا بحصاد الخلايا التائية الخاصة بالمستضد والسيتوكينات التي تمثل الاستجابة المناعية التكيفية في الجسم الحي. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الاستجابات الخلوية والمناعة التكيفية لدى البشر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بحصاد الخلايا التائية الخاصة بالمستضد مباشرة من موقع التفاعل المناعي باستخدام طريقة غير جراحية وآمنة نسبيا.

المبدأ الأساسي للاستدعاء الجلدي هو إيداع المستضد في الطبقة الجلدية من الجلد. في الأفراد الذين لديهم ذاكرة مناعية موجودة للمستضد ، ستنتقل الخلايا التائية إلى موقع التفاعل وتحفز استجابة مناعية موضعية حيث يتم توسيع خلايا تائية معينة واستنساخها في الموقع. يسمح لنا تحريض بثور الشفط فوق هذا التفاعل بحصاد هذه الخلايا التائية المحددة بالإضافة إلى السيتوكينات المنتجة في الجسم الحي.

في عرض الفيديو هذا ، نستخدم اكتئاب ما بعد الولادة كمستضد للاستدعاء. يستخدم اكتئاب ما بعد الولادة بشكل شائع لتشخيص عدوى المتفطرة السلية. ولكنه يؤدي أيضا إلى تفاعلات جلدية لدى الأشخاص الذين تم تطعيمهم مسبقا بلقاح BCG ، كما سترى في هذا الفيديو.

تشمل المواد المستخدمة في اختبار جلد السل مسحات كحولية ، وحقنة سعة ملليلتر واحد بإبرة قصيرة من 27 إلى 30 ، ومحلول PPD معتمد للاستخدام البشري. استخدم محلول PPD من 20 وحدة توبركولين لكل مليلتر. تطهير القارورة باستخدام مسحة كحولية.

ويرجى ملاحظة أن التركيبة قد تختلف بين الشركات المصنعة. ثم حدد موقع الحقن على الجانب البطني من ساعد المتطوع وقم بتطهير المنطقة باستخدام مسحة كحولية. استخدم حقنة معقمة سعة 1 مليلتر بإبرة ثابتة عيار 29 و 12 ملم.

امزج برفق وأطمح 0.1 مل من محلول PPD. تأكد من عدم وجود فقاعات مرئية. اضغط على الجلد ووجه الإبرة بزاوية من خمس إلى خمس عشرة درجة مع توجيه الشطبة لأعلى.

أدخل طرف الإبرة في الطبقة الجلدية من الجلد وتأكد من أن الطرف مرئي تقريبا من خلال البشرة. حقن ببطء 0.1 مل محلول PPD. إذا تم إعطاؤه بشكل صحيح ، فستظهر حطاطة من ستة إلى عشرة ملليمترات على الفور.

تختفي الحطاطة بعد حوالي عشر دقائق. من الممكن إيداع العديد من اكتئاب ما بعد الولادة ، ولكنه قد يتطلب موافقة أخلاقية إضافية. إذا تم إعطاء حقنتين ، فاستهدف أقصى قدر من الفصل مع الحفاظ على مسافة جيدة من منطقة الكوع والمعصم.

يظهر رد الفعل السريري للجلد خلال ال 24 ساعة الأولى ويصاحبه إحساس بالحكة. قياس حجم تفاعل الجلد بعد 48 إلى 72 ساعة من الحقن. عند تقييم الاستجابة، من المهم قياس التصلب وليس الحمامي.

ملامسة تورم القبعة باستخدام إصبعك. ثم ضع علامة على حواف التصلب باستخدام قلم حبر جافي. أخيرا ، استخدم مسطرة ناعمة لقياس قطر التصلب ولاحظ النتائج بالمليمترات.

بعد سبعة أيام ، حان الوقت للحث على نفطة الشفط. لتحريض نفطة شفط الجلد ، استخدم مضخة تفريغ مع غرفة شفط متصلة. استخدم إما جهازا متاحا تجاريا أو جهازا مخصصا.

الأهم من ذلك ، يجب أن تكون المضخة قابلة للتعديل في نطاق 20 إلى 40 كيلو باسكال تحت الصفر وتوفر ضغطا سلبيا ثابتا وموثوقا. يتكون الجزء السفلي من غرفة الشفط من صفيحة ذات ثقب صغير ملامس للجلد. قد تحتوي الألواح على ثقوب مفردة أو متعددة ويمكن تطبيق أحجام مختلفة لتناسب تفاعل الجلد.

يجب أن يسمح الجزء العلوي من الغرفة بالمراقبة البصرية للبثور. قبل الحث ، قم بتطهير الجلد ولوحة الحجرة. تأكد من أن الذراع تستريح بشكل مريح.

قم بتوصيل الغرفة وتأمينها ، هنا باستخدام أحزمة قابلة للتعديل. يجب أن يكون مركز تفاعل الجلد مرئيا من خلال فتحة اللوحة السفلية. قم بتشغيل جهاز الشفط واضبط الضغط السلبي على 20 كيلو باسكال تحت الصفر.

بعد ثلاثين دقيقة ، قم بزيادة الضغط إلى 25 كيلو باسكال تحت الصفر. بعد 60 دقيقة ، قم بزيادة الضغط إلى 30 كيلو باسكال تحت الصفر. واستمر في الضغط هنا حتى تتشكل نفطة واحدة بالكامل.

مرحلة تحريض البثور عادة حوالي ساعة إلى ثلاث ساعات. مع حدوث تكوين الفقاعة الفعلي تدريجيا خلال آخر 30 دقيقة ، كما هو موضح هنا بسرعة عالية. إذا كانت هناك علامات على تمزق البثور أو نزيفها ، فمن المستحسن تحرير الضغط ببطء وإيقاف التحريض مبكرا.

قد تظهر البثور على شكل بثور مدمجة مفردة أو متعددة. غالبا ما ترتبط العملية بإحساس بالحكة. بعد تشكيل البثور بالكامل ، حرر الضغط وقم بإزالة غرفة الشفط بعناية.

في البثور المستحثة بشكل صحيح ، يتم فصل طبقة البشرة تماما عن الطبقة الجلدية من الجلد ، تاركة تجويفا مملوءا بالسوائل. احم البثور عن طريق وضع ضمادة ناعمة على منطقة الجلد المحيطة ووضع غطاء صلب فوق البثرة ، هنا من أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل. قم بتأمين الغطاء بشريط غير مسبب للحساسية متبوعا بضمادة ناعمة قابلة للتمدد.

اطلب من المتطوع الاحتفاظ بالضمادة الواقية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإزالة الضمادة بعناية وقم بتطهير منطقة البثرة باستخدام الرذاذ. استخدم حقنة معقمة سعة 2 مليلتر بإبرة قياس 23 لحصاد محتوى البثور.

أدخل الإبرة في الجانب الجانبي العلوي من سقف البثور واستنشق السائل ببطء. تجنب لمس أرضية التجويف ، ولكن تأكد من حصاد كل السوائل لأن حجم البثور قد يكون منخفضا ، كما في هذا المثال. سوف تلتئم البثور المنهارة دون تندب.

أضف ضمادة واقية فوق البثور. ثم انقل سائل البثور إلى أنبوب معقم. قم بالدوران لمدة أربع دقائق عند 600 جم باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة.

بعد ذلك ، قم بحصاد المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من وسط الخلية. الخلايا الجديدة جاهزة الآن للعد وإجراء مزيد من التحليل. يمكن استخدام خلايا نفطة الشفط في التحليل المختبري ، مثل قياس التدفق الخلوي.

في هذه التجربة مع المتطوعين الذين تم تطعيمهم ب BCG ، تراوح إنتاج الخلايا من 15،000 إلى أكثر من 200،000 خلية لكل نفطة. هنا ، قمنا بعزل الخلايا من نفطة شفط واحدة وقمنا بتحفيز الخلايا مع PPD في المختبر متبوعا بالتلوين وقياس التدفق الخلوي. للمقارنة ، أجرينا تحليلا موازيا على PBMCs من نفس المتطوع الذي تم تطعيمه ب PCG.

في اللوحات ، ترى مجموعات من الخلايا التائية الإيجابية CD4 ملطخة للإنتاج بين الخلايا ل TNF-alpha و interferon-gamma و IL2. في هذا المتطوع ، كان أكثر من 30٪ من الخلايا التائية الإيجابية CD4 المعزولة من الجلد خاصة بالمستضد. في PBMCs ، كان هذا الجزء أقل من 1٪ علاوة على ذلك ، كانت ملفات تعريف السيتوكين الفردية للخلايا البثرية ممثلة لكل من الخلايا التائية للذاكرة المركزية والخلايا التائية المستجيبة ، مما يوضح كيف تسمح لنا هذه الطريقة بدراسة استجابات الذاكرة طويلة العمر التي تم إنشاؤها في الجسم الحي.

هنا ، يوضح الشكل أ أنه يمكن تحليل السوائل التي يتم الحصول عليها من بثور الشفط بحثا عن السيتوكينات المنتجة في الجسم الحي. في الشكل ب ، قمنا بزراعة الخلايا التي تم الحصول عليها من بثور الشفط لمدة أربعة أيام في وجود المتفطرة السلية ، موضحة كيف أن خلايا نفطة الشفط قادرة على إنتاج إنترفيرون جاما و TNF alpha ex vivo. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز وحصاد الخلايا من بثور الشفط بعد ترسب المستضد الجلدي.

في هذا العرض التوضيحي، استخدمنا مستضد ذو أهمية خاصة في مجال أبحاث السل. ولكن ، يمكن أن تكون المبادئ الأساسية لهذه المنهجية مفيدة في مجالات المناعة التكيفية ، أو في التجارب التي تبحث في عوامل استهداف الخلايا التائية. أيضا ، يرجى تذكر أن الأخلاق والسلامة هي أولوية أولى عند العمل مع المتطوعين البشريين.

تذكر أيضا أن العمل مع العينات البشرية يمكن أن يكون خطيرا وأنه يجب دائما اتباع احتياطات السلامة في المختبر.