طراز ماوس تشيميريك كبد البشري الكوليستيرول أسرية باستخدام خلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

وقد أجاب هذا الأسلوب الأسئلة الرئيسية في هذا المجال، مثل كيفية توليد نموذج الماوس الكبري الكبد الإنسان، فرط الكوليسترول في الدم العائلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح بإجراء اختبارات المخدرات في في الجسم الحي. هذه التقنية لديها syndication لعلاج فرط الكوليسترول العائلي.

كعلاج جديد لهذا المرض ، يمكن اختباره باستخدام مثل هذه النماذج الحيوانية chimeric. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة فرط الكوليسترول في الدم العائلي, ويمكن أيضا أن تطبق على أمراض الكبد الموروثة الأخرى. قبل 24 ساعة من النقاب، ذوبان 40 ميكرولترات من مصفوفة خارج الخلية لكل فأرة، عن طريق وضعها في صندوق الثلج، في غرفة باردة.

هدئ حقنة الأنسولين لكل فأر ليتم حقنه وصندوق من 200 نصائح ميكرولتر في ثلاجة درجة مئوية أربع. ساعة واحدة قبل engraftment، دافئة إنزيم تفكك الخلية، تستكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من DNAase 1، إلى درجة حرارة الغرفة ومكان RPMI 1640 المتوسطة، تستكمل مع استبدال المصل 20 في المئة على الجليد. التقاط صور على النقيض من المرحلة من iHeps لتسجيل وضعهم، بما في ذلك مورفولوجيا الخلية والنمو وكثافة الخلايا.

بعد ذلك، قم بغسل كل بئر من iHeps مع 2 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة الكالسيوم والمغنيسيوم الخالي من أيونات PBS مرتين ثم أضف ملليلتر واحد من إنزيم تفكك الخلايا قبل تسخينه إلى كل بئر. إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 8 إلى 10 دقائق. مراقبة مورفولوجيا الخلية تحت المجهر.

عندما تصبح معظم الخلايا جولة, إضافة في حجم متساو من المتوسط البارد في البئر, ماصة الخلايا بلطف لفصل من لوحة, ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لموثوقية خلايا الكبد. إذا كان من الصعب فصل الخلايا عن اللوحة ، يمكن ترك بعضها على اللوحة.

وإذا كانت الخلايا منفصلة، ثم ماص بلطف بعد الطرد المركزي، للحصول على تعليق خلية واحدة. كرر إجراء انفصال الخلية لكل بئر حتى يتم جمع تقريبا جميع الخلايا المرفقة. ثم جهاز طرد مركزي في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي، وإزالة عظمى وإعادة تعليق الخلايا مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني الباردة في أنبوب المليلتر خمسة عشر. Pipette الخلايا بلطف للحصول على تعليق خلية واحدة. ثم، تمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة المجاميع.

عادة، يمكن حصاد مليون إلى مليوني خلية حول بعد قليل من تير-ه. المقبل، إضافة microliters من 0.4 في المئة Trypan حل الأزرق إلى 20 ميكرولترات من تعليق الخلية. عد الخلايا وسجل تركيز تعليق الخلية كما C.Calculate حجم المطلوبة من تعليق الخلية لحقن مليون خلية لكل ماوس.

ثم تخصيص حجم المطلوب من تعليق الخلية في أنابيب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. بعد إزالة ناظر، إعادة تعليق الخلايا في 27.5 ميكرولترات من PBS الباردة لكل فأرة. ثم إضافة حجم متساو من مصفوفة خارج الخلية لحجم النهائي من 55 ميكرولترات لكل ماوس.

الآن، ضع واحدة من حقن الأنسولين الباردة على الجليد. افصل المكبس، ونقل 55 ميكرولترات من تعليق الخلية في الحقنة ومن ثم وضع المكبس مرة أخرى. فقاعات التفريغ بعناية، ووضع حقنة مرة أخرى على الجليد.

تأكد من أن الفئران LRG يتم تخديرها بشكل صحيح قبل البدء في إجراء الحقن. تطبيق مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف أثناء إجراء التخدير. مرة واحدة في الماوس قد فقدت منعكس العضلات إلى التحفيز، وضعه في الحق، الجانبي، موقف decubitus.

ضع طبقة سميكة من كريم إزالة الشعر على منطقة الشق في الجناح الأيسر، واتركها لمدة خمس إلى ثماني دقائق. إزالة كريم إزالة الشعر والشعر عن طريق مسح المنطقة مع وسادة الشاش مبلل بالماء. فرك الجناح الأيسر مع 70 في المئة الإيثانول ثلاث مرات.

ثم حدد مكان الطحال، الذي يمكن رؤيته في الجناح الأيسر. تليها نقع النهائي مع البيتادين للتطهير. بعد استخدام مقص لجعل شق 0.5 إلى واحد سنتيمتر واحد في الجلد وجدار البطن، واستخدام ملقط لإضفاء الطابع الخارجي على الطحال عن طريق سحب بلطف الأنسجة الدهنية المحيطة.

تحقيق الاستقرار بلطف الطحال باستخدام مسحة. أدخل إبرة حقنة الأنسولين من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات في البارينشيما من الطحال ، وحقن بلطف حوالي 50 ميكرولترات من تعليق الخلية. سحب الإبرة ووضع مسحة القطن على الحقن لمدة دقيقة واحدة لمنع النزيف وانسكاب المواد.

العودة الطحال إلى الصفاق، وإغلاق الجرح مع خياطة النايلون خمسة يا. بعد خياطة، ووضع الماوس في قفص نظيف مع سهولة الوصول إلى الطعام والماء. تبدأ عن طريق إزالة الأعضاء الداخلية من الماوس القتل الرحيم حديثا بحيث الشريان الأورطي التنازلي، بالتوازي مع العمود الفقري، مرئية.

ثم تشريح بعيدا الأنسجة المجاورة، وإزالة القلب. استخدام مقص غرامة لتشريح الشريان الأورطي، ووضع كل واحد في الباردة، والمكبس الأوكسجين الحل. بعد جمع، نقل الشريان الأبهر في حل كريبس إلى طبق بيتري المغلفة بالسيليكون.

دبوس النسيج الضام لإصلاح موقف الشريان الأورطي دون تمتد عليه. تحت مجهر معقمة، واستخدام ملقط غرامة ومقص الربيع لتشريح الشريان الأورطي خالية من الأنسجة المحيطة الدهون ومدفنيتيال دون الإضرار جدار السفينة. ثم قطع كل الشريان الأورطي إلى واحد ونصف إلى اثنين من شرائح طول ملليمتر.

المقبل, قطع قطعة سنتيمترين طويلة من 40 ميكرون سميكة الأسلاك غير القابلة للصدأ, وإدراج بلطف في تجويف الشريان الأورطي. عقد السلك لنقل الجزء إلى غرفة الأسلاك myograph، مليئة حل كريبس المؤكسج. لقياس طول شرائح الشريان الأورطي عند دراسة قابلية التقلص، ضع كل قطعة عموديًا بين الفكين، وسجل قراءة D1 على ميكرومتر.

ثم قم بإزالة الجزء وتحريك الفكين معًا. تسجيل القراءة D0 وحساب طول الجزء. بعد ذلك ، المشبك السلك وتأمينه مع مفك البراغي في حين وضع الجزء غير الممدودة بين الفكين.

للتطبيع قبل التجربة، قم بتعيين myograph إلى صفر في الموضع غير الممدودة. ثم تتحرك ببطء الفكين وبصرف النظر ومراقبة التوتر الشريان الأورطي تغيير حتى تصل إلى ثلاثة millinewton. بعد 15 دقيقة، استنزف الحل من غرفة myograph واستبدلها بحل كريبس الطازج.

بعد انتظار آخر 15 دقيقة، مرة أخرى ضبط التوتر إلى ثلاثة millinewton. ثم تغيير حل كريبس القياسية لمحلول كريبس تكملها 60 كلوريد البوتاسيوم ميليمولر، للحث على انكماش لمدة لا تقل عن خمس عشرة دقيقة. شطف مع حل كريبس الطازجة ثلاث مرات، ثم إضافة تركيزات متزايدة من الفينيلفرين.

على سبيل المثال، 10 نانوموللار إلى 100 ميكرومولار. ثم، بعد غسل بها مع محلول كريبس القياسية، إضافة تركيز واحد من فينيليفرين، في حوالي 70 في المئة من الانكماش الأقصى. عندما يكون الانكماش مستقرًا، أضف تركيزات متزايدة من الأستيل كولين على فترات دقيقة.

على سبيل المثال، واحد إلى ثلاثة نانوموللار إلى 10-30 ميكرومولار للحث على توسع الأوعية. تُظهر هذه الصورة صورة تمثيلية كاملة المقطع الممسوحة ضوئيًا لألبومين بشري يلطخ في كبد الماوس الذي يُعاد اصمره بمستقبلات البروتين الدهني المنخفضة نقصًا في مستقبلات البروتين الدهني iHeps. الأسهم تشير إلى مجموعات من iHeps الإنسان نقش في كبد الماوس.

وينظر إلى مجموعات من iHeps الإنسان engrafted في مزيد من التفاصيل هنا. يوضح الرسم البياني scatterplot هذا النسبة المئوية للخلايا الإيجابية التي تمت إعادة إليها في اللولب البشري المقابلة لـ iHep التي تحتوي على مناطق في كبد الماوس ، من iPSCs مانحة مختلفة. هذه هي صورة تمثيلية من تلطيخ المناعة الكيميائية للنوى البشرية في كبد الماوس، مع فرط الكوليسترول العائلي iHeps.

الرسم البياني شريط يظهر النسبة المئوية من النوى البشرية repopulati إيجابية iHeps من مختلف المانحة iPSCs في كبد الماوس LRG. هذه هي الصور التمثيلية للألبومين البشري والنوى البشرية تلطيخ على قسمين متتاليين من كبد الماوس ، وإعادة إسكانها مع iHeps من النوع البري. وأخيرا، تظهر هذه الصورة توسع الأوعية التي تعتمد على الغدد الأورطية في فرط الكوليسترول في الدم البشري الفئران الكبري، استجابة لزيادة تركيزات أستيل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد فئران الكَبَل البشري ، باستخدام خلايا الكبد المشتقة من iPSC البشرية.