نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي

الهدف العام من نموذج إصابة الخلايا العصبية الحسية ذبابة الفاكهة هو الجمع بين التصوير الحي في الجسم الحي ، وحص العضلات بالليزر ثنائي الفوتون / استئصال العضلات بالليزر ، وصندوق الأدوات الوراثي القوي للذبابة في منصة لفحص المحفزات المحتملة ومثبطات التجديد العصبي. ستساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال التوليد العصبي ، مثل تحديد منظم داخلي وخارجي جديد للتوليد العصبي ، سواء في الجهاز العصبي المحيطي أو المركزي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن فحص المرشحين الجدد للتجديد العصبي بطريقة سهلة وسريعة ورخيصة.

على الرغم من أن هذا النظام يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة للتجديد العصبي ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى ، مثل الأمراض التنكسية العصبية والتفاعلات بين الخلايا الدبقية العصبية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الإعدادات التجريبية المختلفة التي تستخدم أنواعا مختلفة من الخلايا العصبية تستخدم لنمذجة المحور العصبي مقابل تجديد التغصن. لجمع اليرقات ، قم بإعداد زجاجات الثقافة على النحو التالي.

استخدم شفرة لعمل ثقب 1.5 سم في أحد جدران زجاجة ثقافة ذبابة الفاكهة ، واملأ الحفرة بكرة قطنية للتهوية. ثم ضعي القليل من معجون الخميرة على طبق أجار عصير العنب ، واستخدمي الطبق لسد الفتحة الرئيسية للزجاجة. في مثل هذه الزجاجة ، قم بإعداد صليب من 10 إناث عذراء وخمسة ذكور ، وقم بتغيير اللوحة يوميا أثناء الزراعة عند 25 درجة مئوية.

استزراع الصفائح المجمعة بمنديل مبلل مبلل بحمض البروبيونيك الخفيف لمنع التلوث. من الصفائح المستزرعة ، حصاد اليرقات في المرحلة المطلوبة باستخدام الملقط. انقل اليرقات المقطوفة برفق إلى طبق أجار عصير العنب الجديد بدون معجون الخميرة.

بعد تنظيف أنفسهم عن طريق الزحف ، يمكن تصويرهم. لبدء كل جلسة تصوير، قم بتشغيل ليزر التصوير والمجهر. للإصابة ، استخدم مجهر ثنائي الفوتون.

في برنامج التصوير ، اضبط الليزر لعرض GFP عند 930 نانومتر بقوة قصوى تبلغ 1950 مللي واط. حدد وضع مسح الخط ، وافتح الثقب بالكامل. ثم قم بزيادة شدة الليزر إلى حوالي 20٪ من الطاقة الكاملة لإحداث إصابة PNS ، أو إلى 50٪ إلى 100٪ من الطاقة الكاملة لإحداث إصابة VNC.

بعد ذلك ، حدد إطار 512 بكسل مربع للمسح الضوئي ، واستخدم أعلى سرعة مسح ممكنة. استخدم متوسط عدد واحد ، وعمق بت من ثمانية بتات. ثم اضبط الكسب على حوالي 750 ، واضبط الإزاحة على الصفر.

الآن احفظ هذا البروتوكول التجريبي المحدد مسبقا ك 2P GFP 930 Ablaation ، مما يسمح بإعادة الاستخدام بسهولة في المزيد من التجارب. للتصوير بعد الإصابة ، استخدم مجهر متحد البؤر. قم أولا بإعداد ليزر الأرجون عند 488 نانومتر.

حدد علامة التبويب اكتساب ثم حدد Z Stack. تحت الليزر ، قم بتشغيل ليزر الأرجون 488 نانومتر. انتقل بعد ذلك إلى القنوات ، وحدد ليزر 488 نانومتر ، وقم بزيادة طاقة الليزر إلى خمسة إلى 10٪ بالنسبة للثقب ، استخدم الخيار لوحدة منطقة واحدة إلى اثنتين.

ثم اضبط الكسب على 650. الآن في وضع الاكتساب ، حدد 1024 بكسل مربع كمسح ضوئي للإطار. استخدم أقصى سرعة مسح.

استخدم متوسط عدد اثنين وعمق بت ثمانية بتات. احفظ هذا البروتوكول قبل التجريبي بتنسيق GFP Imaging. ابدأ بتخدير اليرقات.

في غطاء الدخان ، ضع طبقا زجاجيا مقاس 60 ملم في طبق بتري بلاستيكي يبلغ طوله 15 سم. ثم قم بطي قطعة من المناديل الورقية وضعها في الطبق الزجاجي. ضع صفيحة أجار العنب على المنديل بعد إضافة ثنائي إيثيل الأثير.

بعد ذلك ، على شريحة زجاجية ، ضع قطرة واحدة من زيت الهالوكربون 27 في المنتصف ، وضع بقعة من الشحوم المفرغة على كل زاوية من الزوايا الأربع. ثم استخدم ملقط لنقل يرقة واحدة إلى صفيحة الأجار ، وقم بتغطية الطبق الزجاجي لتخدير اليرقة. بمجرد أن تتوقف اليرقة عن الحركة ، انقلها بعناية إلى زيت الهالوكربون ، مع وضع رأسها في وضع مستقيم.

ثم ضع غطاء على الشريحة واضغط عليه برفق حتى تلامس اليرقة. بعد ذلك ، استخدم قوة لطيفة لتحريك زلة الغطاء لدحرجة الخلايا المراد استئصالها إلى حيث سيضربها ليزر الفوتون الثنائي بسهولة. سيختلف الموقع ، اعتمادا على الخلايا العصبية المستهدفة.

الآن قم بتأمين التجميع على مرحلة المجهر ثنائي الفوتون ، وركز على الخلايا ذات الأهمية ، باستخدام هدف غمر الزيت 40X. في البرنامج ، قم بالتبديل إلى وضع المسح وقم بتحميل البروتوكول المحفوظ. تأكد من فتح الثقب بالكامل.

ثم في الوضع المباشر ، احصل على صورة جيدة لمنطقة الاهتمام. بعد ذلك ، أوقف الفحص المباشر حتى يصبح الزر Crop متاحا. باستخدام وظيفة الاقتصاص ، اضبط نافذة المسح لتركيز المنطقة المستهدفة على موقع الإصابة المحتمل فقط.

ثم افتح نافذة تصوير جديدة. الآن تقليل سرعة المسح وزيادة شدة الليزر. ثم قم بتبديل الزر المستمر لبدء الفحص وإيقافه.

راقب بعناية. بمجرد أن تكون هناك زيادة كبيرة في الإزهار ، قم بإنهاء الفحص. بعد ذلك ، ارجع إلى نافذة التصوير الأصلية وحدد الوضع المباشر ، وابحث عن المنطقة التي تم استهدافها للتو عن طريق ضبط التركيز.

من المؤشرات الجيدة على الإصابة الناجحة ظهور فوهة بركان صغيرة أو هيكل يشبه الحلقة أو حطام موضعي في موقع الإصابة. إذا كانت قوة الليزر عالية جدا ، فستكون هناك منطقة كبيرة متضررة مرئية ، والتي يمكن أن تكون قاتلة. الآن قم بإزالة زلة الغطاء بعناية ، وانقل اليرقة المصابة إلى طبق جديد مع معجون الخميرة.

ضع الطبق في طبق 60 ملم ، جنبا إلى جنب مع منديل مبلل بحمض البروبيونيك. ثم أعد اللوحة إلى درجة حرارة الاستزراع. للتصوير اللاحق لليرقة ، استفد من الإعداد متحد البؤر المحفوظ ، واجمع صور مكدس Z بهدف 25X.

تأكد من تضمين نقطة التطبيع ، بحيث يمكن تحديد التجديد كميا. باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم التحقيق في تجديد الخلايا العصبية من الفئة الثالثة والرابعة DA. عادة ، أصيبت ثلاث أو أربع خلايا عصبية على الجانب الأيمن من أجزاء البطن من A7 إلى A2.

على وجه التحديد ، تم استهداف الخلايا العصبية DDAF من الفئة الثالثة والفئة الرابعة V Prime ADA. تم تصوير اليرقات في 24 و 48 و 72 ساعة بعد الإصابة. في غضون 24 ساعة ، عادة ما تكمل المحاور البعيدة التنكس ، وكان جذع المحور العصبي مرئيا بسهولة.

في 48 ساعة ، كان من الممكن تقييم التجديد في الخلايا العصبية DA من الفئة الرابعة. حوالي 70٪ من هذه الخلايا العصبية تتجدد خارج موقع الإصابة. حتى بعد 72 ساعة ، كان من الواضح أن الخلايا العصبية من الفئة الثالثة DA فشلت في إعادة النمو.

تم تقييم ذلك بناء على الملاحظات المتكررة لمخاريط النمو المتوقفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد التجربة ، وإجراء إصابة ثنائية الفوتون ، وتقييم النتائج. بمجرد إتقانها ، تستغرق هذه التقنية 15 دقيقة لكل يرقات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مقارنة النمو التجريبي مع الضوابط المقابلة ، جنبا إلى جنب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة مثل التلوين المناعي للإجابة على المزيد من الأسئلة ، مثل ما إذا كانت إصابة المحاور يمكن أن تسبب نقل البروتين ، مما يؤدي إلى تغيير المسار. منذ تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف التجديد العصبي في الخلايا العصبية الحسية لليرقات ذبابة الفاكهة.

أخيرا ، لا تنس أن العمل مع ثنائي إيثيل الأثير يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل إجراء تخدير اليرقات في غطاء الدخان ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.