Name: قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12 (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: اكتشف مراقبة نقل الإلكترون عبر غشاء البلازما في الوقت الفعلي باستخدام خلايا C2C12 وتحليل الطيف الضوئي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات التوازن الأكسدة الاختزال في الخلايا الحية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن أشكر بيل توماس، لين ماتاتهيل ومارك مانينو ونج باتل لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد هذا العمل جائزة "الخدمة الصحية العامة في الولايات المتحدة" R15DK102122 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي (NIDDK) لجوناثان فيشر. محتوى المخطوطة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية نيدك أو "المعاهد الوطنية للصحة".

ملاحظة: انظر الشكل 1 نظرة تخطيطية للخطوات الرئيسية.
1-مقايسة الحد WST-1
<ol><li>تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة باستخدام الخلية القياسية الثقافة الإجراءات7 في صفيحة 96-كذلك استخدام الصفوف A-f.<ol>
<li>استخدام وسيلة تمايز تتألف من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع مصل الحصان 2% و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 مغ/مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.</li>
		<li>عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، الملحق وسائط التمايز مع 100 حمض الأسكوربيك ميكرومتر. السماح للخلايا لاحتضان في التمييز بين وسائل الإعلام ل ~ 24-48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد المخزون الحلول WST-1 والدورة الشهرية.<ol>
<li>لجعل أسهم 10 مم WST-1، حل ز 0.033 WST-1 (وزن الصيغة (مهاجم): 651.34 g/mol) في 5 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS). مخزن في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>جعل مخزون 5 مم من الدورة الشهرية، حل 0.0023 ز من الدورة الشهرية (مهاجم: 306.34 g/mol) في 1.5 مل من منزوع ح2س (diH2س). تخزين في-20 درجة مئوية، وحماية من الضوء.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 0.0108 ز الجلوكوز لتركيز نهائي من 5 مم إلى 11.4 مل من برنامج تلفزيوني أو حبيس مخزنة المالحة (ميزانيات؛ 20 مم حبيس الصوديوم الملح 140 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2.5 مم MgSO4، 1 مم كاكل2). إضافة ميليلتر 480 ملم 10 WST-1 لتركيز نهائي من 400 ميكرون وميليلتر 48 مم 5 الدورة الشهرية لتركيز نهائي من 20 ميكرومتر.</li>
	<li>عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. إلى قاسمة واحد، إضافة 6 ميليلتر من diH2س وإلى قاسمة الأخرى إضافة ميليلتر 6 2 كو/مل AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر.</li>
	<li>عند رصد مشاركة دِيسمُوتاز في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. قاسمة واحد، أضف ميليلتر 55 م 0.1 مشرف4 المخزن المؤقت وإضافة إلى قاسمة الأخرى ميليلتر 55 6.5 كو/مل الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر.</li>
	<li>تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. نضح وسائط الإعلام وإضافة 150 ميليلتر PBS. ثم نضح برنامج تلفزيوني. ملاحظة: يتم المقايسة مع خلايا مطلي، المرفق. وهكذا، لا يوجد الطرد المركزي أو استخدام التربسين في عملية الغسيل.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر من WST-1 الحل (-) الهيئة العامة للسدود أو (-) AO لأعمدة 1-6 وإضافة 100 ميليلتر حل WST-1 (+) الهيئة العامة للسدود أو (+) أو إلى أعمدة 7-12 في لوحة 96-جيدا. استخدام الصفوف زاي وحاء كعناصر أساسية (أي، لرصد التغير في امتصاص في الكاشف وحدها في الآبار دون الخلايا).</li>
	<li>قياس امتصاص القيم باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل 10 دقيقة ح 1 في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط.</li>
	<li>بعد القراءة، نضح وسائط الإعلام وتغسل كل جيدا مع 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم نضح برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>حساب التغير في امتصاص لكل بئر بطرح امتصاص الأولية لبئر من امتصاص في أي وقت لذلك جيدا. تصحيح هذا التغيير من أجل التغيير في امتصاص (أن وجدت) التي لوحظت في الآبار الخلفية (أي، الآبار مع الحل المقايسة ولكن أي من الخلايا).</li>
	<li>للتحليل، تطبيع البيانات امتصاص لقياس التحكم 60 دقيقة أو غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني أو ميزانيات وثم إجراء مقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك على بروتين.</li>
	<li>إضافة مستوى ألبومين المصل البقري (BSA) 2 مغ/مل (تتراوح بين 0.5-2 ميليلتر للمنحنى المعياري، تبعاً لدرجة التقاء الخلايا) إلى الآبار فارغة (الصفوف زاي وحاء)، ثم إضافة الكاشف اتفاق التعاون الأساسي لجميع الآبار.</li>
	<li>التحديد الكمي للبيانات عن طريق نمول WST-1 تخفيض كل ميكروغرام من البروتين. استخدام 37 مم-1 سم-1 22 كمعامل الانقراض WST-1 انخفاض في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط.</li>
</ol>2-دبيب مقايسة الحد
<ol><li>تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة بنفس إجراء الخطوة 1، 1.</li>
	<li>إعداد المخزون 10 مم دبيب الحل كما يلي. حل ز 0.029 من دبيب (مهاجم: 290.08 g/mol) في 10 مل من diH2O. تأكيد تركيز دبيب بقياس امتصاص 600 نيوتن متر مع جهاز المطياف الضوئي. استخدم 1 مم-1 سم-1 23 كمعامل الانقراض دبيب انخفاض 600 نانومتر. مخزن في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إضافة 0.0108 ز الجلوكوز لمل 11.880 من برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 5 ملم. إضافة ميليلتر 120 ملم 10 دبيب لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.</li>
	<li>عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. إلى قاسمة واحد، إضافة 6 ميليلتر من diH2س وإلى قاسمة الأخرى إضافة ميليلتر 6 2 كو/مل AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر.</li>
	<li>عند رصد مشاركة دِيسمُوتاز في تبميت، تقسيم الحل إلى اثنين 6 مل مختبرين. قاسمة واحد، أضف ميليلتر 55 م 0.1 مشرف4 المخزن المؤقت وإضافة إلى قاسمة الأخرى ميليلتر 55 6.5 كو/مل الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر.</li>
	<li>نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا في 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميليلتر من دبيب الحل (-) الهيئة العامة للسدود أو (-) AO لأعمدة 1-6 وإضافة 100 ميليلتر من دبيب الحل (+) الهيئة العامة للسدود أو (+) أو إلى أعمدة 7-12 في لوحة 96-جيدا. استخدام الصفوف ز وإرادة ح كعناصر أساسية (أي، لرصد التغير في امتصاص في الكاشف وحدها في الآبار دون الخلايا).</li>
	<li>قياس امتصاص في 600 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل 10 دقيقة حاء 1 قياس التغير في امتصاص نسبة إلى عنصر التحكم في 60 دقيقة مشابهة للخطوات 1، 1، 9-13.</li>
</ol>3-تحديد عما إذا المتقبلين للإلكترون المخفضة من ركائز AO أو أبله
<ol><li>إلى 5.436 مل من برنامج تلفزيوني أو ميزانيات، إضافة ميليلتر 240 ملم 10 WST-1 لتركيز نهائي من 400 ميكرون وميليلتر 24 مم 5 الدورة الشهرية لتركيز نهائي من 20 ميكرومتر.<ol>
<li>دبيب، إضافة 60 ميليلتر من 10 مم دبيب، لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر، لمل 5.940 من برنامج تلفزيوني أو ميزانيات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر لإيجاد حل لكل الخير في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا في غياب الخلايا وقياس امتصاص في جهاز المطياف الضوئي في 438 شمال البحر الأبيض المتوسط، ل WST-1، أو 600 نانومتر، دبيب.</li>
	<li>إضافة 1 ميليلتر من اسكوربات 10 ملم إلى نصف الآبار لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر. مراقبة امتصاص حتى أن يستقر.</li>
	<li>عند التثبيت، إضافة 1 ميليلتر من 200 يو/مليلتر AO لتركيز نهائي 2 يو/مليلتر لكل بئر أو إضافة 1 ميليلتر من 6 كو/mL الأحمق لتركيز نهائي من 60 يو/مليلتر لكل خير ورصد امتصاص ح 1.</li>
</ol>

<ol><li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li>
<li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li>
<li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US8239207">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li>
<li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li>
<li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01279296">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li>
<li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89(2017).</li>
<li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li>
<li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li>
<li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li>
<li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2%2B+as+second+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li>
<li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho%280%29HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).</li>
<li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li>
<li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+oxygen+consumption%3A+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li>
<li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li>
<li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li>
<li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals%3A+functional+significance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane%2C+Cell+Surface%2C+and+Serum+NADH-Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li>
<li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb1958/41/6/41_6_1118/_article">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+New+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2%2C6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).</li>
<li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+%28WST-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li>
<li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li>
<li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+%28phenazine+methosulfate%29+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li>
<li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li>
<li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0,22&cluster=5895405450791166684">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt%2C+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan%3A+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li>
<li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+%28PI3K%29+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li>
<li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+%28B-CPAP%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thyroid+research%22%5BJournal%5D)">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li>
<li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li>
<li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li>
<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وقد قدمنا طريقتين لاستخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية، WST-1 ودبيب، في فحوصات سبيكتروفوتوميتريك لرصد تبميت في ميوتوبيس C2C12. مع نمو خطوط الخلايا في الإجراءات القياسية الثقافة وقارئ لوحة جهاز المطياف الضوئي، من الممكن رصد تبميت مع هذه متقبلون إلكترون في مقايسة ميكروسكوبية بسيطة. WST-1 الحد استنساخه من بئر إلى داخل فحص، ولكن هناك تقلب يوما بعد يوم. معامل الاختلاف (CV) الاستفادة من برنامج تلفزيوني كالمخزن المؤقت اليومية هو 0.18 والسيرة الذاتية استخدام ميزانيات المخزن المؤقت هو 0.23.
من المؤلف...

قدرة تنقية البلازما الأغشية للحد من المتقبلين للإلكترون أدى إلى ت ري أن غشاء البلازما على قدرات الكامنة الأكسدة1. رأيت سابقا في الفطريات والنباتات، والحيوانات، تبميت عملية مشتركة بين الكائنات الحية متعددة2،3،،من45. على وجه التحديد، هذه العملية قد تجلى في Saccharomyces cerevisiae، الجزرة الخلايا والكريات الحمراء، لمفاوية، osteosarcoma، وسرطان الجلد، الضامة، والهيكل العظمى والعضلات والعدلات2،3، 4 , 5 , 6 , 7-يشارك في عملية نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما لتقليل المؤكسدات خارج الخلية، تبميت في العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك: الخلية النمو5،8، بقاء الخلية9، الحديد استقلاب10، الخلية إشارات11،،من1213، والحماية من الأكسجين التفاعلية الأنواع12،،من1415. بسبب المشاركة تبميت في العديد من الوظائف الخلوية، قد تم الافتراض باختلال تبميت للمساهمة في تطوير بعض الظروف الصحية الخطيرة، بما في ذلك السرطان16،17من أمراض القلب والأوعية الدموية، والتمثيل الغذائي متلازمة18.
هناك عدة طرق لمراقبة نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما، ولكن الأسلوب الأكثر استخداماً لتقييم الحد المتقبلين الإلكترون خارج الخلية عن طريق فحوصات اللونية. متقبلون الإلكترون خارج الخلية استخداماً هي أملاح تيترازوليوم ودبيب وفيكن وفيريسيتوتشرومي ج19،20. الملح tetrazolium الأكثر استخداماً معروف ملح من الجيل الثاني ك WST-119. هذا المركب أسهل لاستخدامها في فحوصات قياس الألوان مقارنة بالجيل الأول tetrazolium أملاح نتيجة الفريقين المشبعة بالفلور أوكتين، التي تزيد من القابلية للذوبان في الماء،21. WST-1، بالاشتراك مع ميثوسولفاتي فينازيني-1-ميثوكس يقبلون الإلكترون المتوسطة (مبمس)، يتم تقليل في اثنين واحد إلكترون نقل الأحداث. هذا الحد يتغير شكل WST-1 المؤكسدة ضعيفة الملون إلى20،فورمازان أكثر كثافة، والأصفر22. وقد WST-1 معامل انقراض مولى عالية 37 × 103 م-1سم-1، مما أدى إلى مقايسة عالية حساسية21،22. دبيب كما يستخدم يقبلون إلكترون خارج الخلية لمراقبة تبميت. فقد ثبت أنه يمكن تخفيض دبيب اكستراسيلولارلي من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون23،24. بسبب انعدام متقبلون إلكترون الوسيطة، دبيب يمكن مباشرة الإلكترونات البيك آب من غشاء البلازما، وعلى عكس WST-124. مشابهة دبيب، ثبت فيكن أن تقلص اكستراسيلولارلي إلى فيروسيانيد من تبميت دون المساعدة من وسيط إلكترون متقبلون19،24. على عكس WST-1 ودبيب، قد فيكن معامل انقراض مولى منخفضة مما يؤدي إلى حساسية فحص السفلي9. آخر يقبلون الإلكترون خارج الخلية المستخدمة عادة لرصد تبميت هو فيريسيتوتشرومي جيم على غرار WST-1، فيريسيتوتشرومي ج الحد من الزيادات باستخدام يقبلون الإلكترون المتوسطة، مبمس22. رغم ذلك، خلافا WST-1 الأسلوب ج فيريسيتوتشرومي أقل حساسية بسبب خلفية عالية ومعامل انقراض مولى منخفضا22.
هنا نقدم طريقة للتحليل في الوقت الحقيقي من تبميت عن طريق فحوصات سبيكتروفوتوميتريك. تستخدم الأسلوب متقبلون الإلكترون خارج الخلية WST-1 ودبيب، كلا منهما لديها معامل انقراض مولى عالية رغم كونها أقل تكلفة مقارنة بأخرى يشيع استخدامها متقبلون الإلكترون خارج الخلية مثل ج فيريسيتوتشرومي. يمكننا الاستفادة من فينازيني ميثوسولفاتي (PMS) بدلاً من مبمس لديهم التركيب الكيميائي مماثلة والدورة الشهرية أقل تكلفة بكثير. مبمس الهيدروكسى مستقرة وهو سمة هامة لمجموعة تجاري يحتاج إلى حياة طويلة الجرف. بيد أننا جعل الدورة الشهرية طازجة لكل فحص، حيث الاستقرار لا ينبغي أن يكون مشكلة. ونقدم أيضا وسيلة لتقييم التفاعلات الانزيمية الممكنة (انظر الشكل 1) بين يقبلون الإلكترون خارج الخلية والأنزيمات التي يمكن استخدامها لوصف عملية تبميت كذلك. على وجه التحديد، تحديد الإنزيمات AO والهيئة العامة للسدود يمكن أن تستخدم أي جزء من تبميت بسبب النقل اسكوربات أو الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية، هما الأساليب الشائعة للإلكترونات بنقلها عبر غشاء البلازما.

<table><tbody><tr><td>C2C12 myoblasts</td> مجموعة <td>ثقافة النوع الأمريكي &nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr> مركب مصل الجنيني Plex من <tr><td>Dulbecco متوسط - منخفض الجلوكوز</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex مركب مصل حيواني</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>بنسلين ستربتومايسين</td><td>سيجما</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>مصل الحصان</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's محلول ملحي مخزن فوسفات</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>تريبسين-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>أطباق استزراع 15 سم</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96 ألواح ثقافة الآبار</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2- (4-يودوفينيل) -3- (4-نيتروفينيل) -5- (2،4-ديسولفوفينيل) -2H-تيترازوليوم ملح الصوديوم (WST-1)</td><td>Accela ChemBio &nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>فينازين ميثوسلفات&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>حمض الأسكوربيك</td><td>L-سيجما</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>أسكوربات أوكسيديز &nbsp;</td><td>سيجما</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>سوبر أكسيد ديسموتاز &nbsp;</td><td>سيجما</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2،6-ثنائي كلورو إندوفينول ملح الصوديوم &nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - الجلوكوز</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES ملح الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>Fisher Scientific &nbsp ؛</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات</td><td>سيجما</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات</td><td>سيجما</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم</td><td>فيشر العلمي &nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>بيرس BCA بروتين الفحص كيت</td><td>الحرارية العلمية</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I مقياس الطيف</td> الضوئي <td>Biotek</td><td>Insturments توقف&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 مقياس الطيف</td> الضوئي <td>الحراري العلمي</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>صفيحة دقيقة PureGrade 96 جيدا ، F- bottom ، شفافة ، غير معالجة ، غير معقمة</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>الحديد (II) كلوريد رباعي الهيدرات</td><td>سيجما</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الحديد (II) سباعي الهيدرات</td><td>سيجما</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>هيبوكسانثين</td><td>سيجما</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>زانثين أوكسيديز</td><td>سيجما</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>مايكروسوفت</td><td></td><td></td></tr><tr><td>آر ستوديو</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek</td><td>Insturments discontinued discontinued &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس c2c12

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل (تبميت) يلعب دوراً في حماية الخلايا من الإجهاد التخفيض داخل الخلايا، فضلا عن الحماية من الأضرار بالخلية للتأكسد. هذه العملية لنقل الإلكترونات من تأشيب داخل الخلية إلى خارج الخلية للتأكسد ليست محددة تحديداً جيدا. هنا نقدم فحوصات سبيكتروفوتوميتريك من ميوتوبيس C2C12 لرصد استخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية تبميت: تيترازوليوم للذوبان في الماء الملح-1 (WST-1) و 2, 6-ديتشلوروفينوليندوفينول (دبيب أو دسيب). من خلال الحد من هذه متقبلون الإلكترون، نحن قادرون على مراقبة هذه العملية في تحليل في الوقت الحقيقي. مع إضافة الإنزيمات مثل اسكوربات أوكسيديز (AO) وفائق أكسيد الفاءق (الأحمق) إلى فحوصات، يمكننا تحديد أي جزء من تبميت هو سبب إنتاج التصدير أو فائق أكسيد اسكوربات، على التوالي. بينما أبدى WST-1 تحقيق نتائج مستقرة مع خلفية منخفضة، دبيب كانت قادرة على أن تكون إعادة المؤكسد بعد إضافة AO والهيئة العامة للسدود، الذي تجلى بتحليل سبيكتروفوتوميتريك. يوضح هذا الأسلوب مقايسة سبيكتروفوتوميتريك في الوقت الحقيقي، وكذلك متعددة، سريعة مع مزايا أكثر من الأساليب الأخرى المستخدمة لرصد تبميت، مثل سيانيد (فيكن) وتخفيض فيريسيتوتشرومي ج.

إحصاءات أجريت مع ANOVA مع التدابير المتكررة باستخدام البرمجيات الإحصائية RStudio25. يتم الإشارة إلى أحجام العينات في أساطير الرقم.
واستخدمت لرصد تبميت، ميوتوبيس C2C12 جنبا إلى جنب مع الإلكترون خارج الخلية المتقبلين، WST-1 ودبيب. AO واستخدمت لتحديد أي جزء من WST-1 والحد من دبيب يرجع efflux اسكوربات والهيئة العامة للسدود واستخدمت لتحديد أي جزء من الحد WST-1 كان بسبب الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية. كما هو...

والهدف من هذا البروتوكول هو رصد سبيكتروفوتوميتريكالي البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل الاستفادة من المتقبلين للإلكترون خارج الخلية وتحليل التفاعلات الانزيمية التي قد تحدث مع هذه متقبلون الإلكترون خارج الخلية.

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة عملية نقل الإلكترون عبر غشاء البلازما في الوقت الفعلي من خلال فحوصات القياس الطيفي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الرادوكس فيما يتعلق بآلية نقل الإلكترون عبر غشاء البلازما وكيفية الحفاظ على بيئة الأكسدة والاختزال في الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الاختبار هو اختبار طيفي ضوئي سريع في الوقت الفعلي.للبدء ، قم بتثبيت خلايا الالتصاق C2C-12 في مرتين من 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في الصفوف من A إلى F من لوحة بئر 96 ، ثم قم بتغطية الخلايا بوسائط النمو. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة في الثقافة ، قم بشفط وسط النمو ، واغسلها ب 150 ميكرولتر من PBS ، واستبدلها بوسط التمايز ، واحتضان الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة إضافية.بعد ذلك ، قم بإعداد حلول WST-1 و PMS. اصنع محلول مخزون 10 ملليمولار من WST-1 عن طريق إذابة 033 جراما من WST-1 في خمسة ملليلتر من PBS. ثم ، دوامة الحل.بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مخزون الدورة الشهرية عن طريق إذابة 0023 جراما من PMS في 1.5 مل من الماء المتأين. دوامة الحل. لتحضير محلول العمل ، أضف الجلوكوز إلى PBS لصنع 11.4 مل من محلول الجلوكوز بخمسة ملليمول.إلى هذا الحل ، أضف 480 ميكرولتر من محلول مخزون WST-1 للتركيز النهائي 400 ميكرومولار WST-1 و 48 ميكرولتر من محلول مخزون PMS للتركيز النهائي 20 ميكرومولار PMS. دوامة الحلول للخلط. ثم قسم المحلول إلى حصتين من ستة ملليلتر.اعتمادا على الفحص ، أضف المكونات ذات الصلة الموضحة هنا. مع إعداد الحلول الآن ، استنشق وسائط التمايز من الخلايا واغسلها مرة واحدة باستخدام 150 ميكرولتر من PBS. قم بإزالة PBS وأضف 100 ميكرولتر من aliquot واحد إلى أعمدة من واحد إلى ستة.وأضف 100 ميكرولتر من aliquot اثنين إلى الأعمدة من سبعة إلى 12 من 96 لوحة البئر. ضع لوحة البئر 96 في قارئ الألواح وقم بقياس قيم الامتصاص كل 10 دقائق لمدة ساعة واحدة عند 438 نانومتر. بعد القراءة النهائية ، استنشق الوسائط واغسل كل بئر ب 150 ميكرولتر من PBS.ثم استنشق PBS. للتحليل ، احسب التغير في الامتصاص لكل بئر عن طريق طرح الامتصاص الأولي للبئر من الامتصاص في أي نقطة زمنية لاحقة لنفس البئر. قم بتصحيح هذا التغيير بناء على التغير في الامتصاص الذي لوحظ في آبار الخلفية.بمجرد تصحيح الخلفية ، قم بتطبيع بيانات الامتصاص إلى قياسات التحكم لمدة 60 دقيقة. بدلا من ذلك ، قم بتطبيع محتوى البروتين في كل بئر باستخدام اختبار بروتين BCA القياسي. أخيرا ، حدد البيانات للحصول على مقدار تقليل WST-1 بواسطة ميكروغرام من البروتين.لبدء مقايسة تقليل DPIP ، قم بتنمية وتمييز خلايا الالتصاق C2C-12 ، كما هو موضح في مقايسة تقليل WST-1. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول مخزون يحتوي على 10 ملليمولار DPIP عن طريق إذابة 029 جراما من DPIP في 10 مل من الماء المتأين. ثم دوامة الحل.تأكد من التركيز عن طريق قياس امتصاص المحلول عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. لعمل محلول العمل ، أضف 120 ميكرولترا من محلول مخزون DPIP سعة 10 ملليمولار إلى 11.88 مل من محلول خمسة ملليمولات من الجلوكوز و PBS للحصول على تركيز عمل DPIP نهائي يبلغ 100 ميكرومولار. ثم ، دوامة الحل.ثم قسم المحلول إلى اثنين من ستة ملليلتر. اعتمادا على الفحص ، أضف المكونات ذات الصلة الموضحة هنا. مع إعداد الحلول الآن ، استنشق وسائط التمايز من الخلايا واغسلها مرة واحدة باستخدام 150 ميكرولتر من PBS.قم بإزالة PBS وأضف 100 ميكرولتر من aliquot واحد إلى الأعمدة من واحد إلى ستة ، و 100 ميكرولتر من aliquot اثنين إلى الأعمدة من سبعة إلى 12 من 96 لوحة البئر. ضع لوحة البئر 96 في قارئ الألواح وقم بقياس قيم الامتصاص كل 10 دقائق لمدة ساعة واحدة عند 600 نانومتر وقم بتحليل القيم الناتجة كما هو موضح في تحليل مقايسة التخفيض WST-1. للبدء ، قم بإعداد حلين.أولا ، قم بإعداد ستة ملليلتر من 400 ميكرومولار WST-1 و 20 ميكرومولار PMS في PBS. ثم قم بإعداد ستة ملليلتر من محلول 100 ميكرومولار من DPIP و PBS. قم بإعداد أول لوحة بئر 96 عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول WST-1 / PMS إلى الصفوف من A إلى D في صفيحة مسطحة القاع في حالة عدم وجود خلايا ، وقياس الامتصاص في مقياس الطيف الضوئي عند 438 نانومتر.ثم قم بإعداد لوحة ثانية من 96 بئر عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول DPIP إلى الصفوف من A إلى D في لوحة سفلية مسطحة في حالة عدم وجود خلايا ، وقياس الامتصاص في مقياس الطيف الضوئي عند 600 نانومتر. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من 10 ملليمولار أسكوربات إلى نصف الآبار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار. راقب الامتصاص في اللوحة حتى تستقر.بعد ذلك ، كرر مع DPIP. عند الاستقرار ، حدد ما إذا كانت مستقبلات الإلكترون المنتجة عبارة عن ركائز. بالنسبة للأسكوربيت أوكسيديز للأكسيد الفائق ، عن طريق إضافة أوكسيديز الأسكوربات أو أكسيد فائق ، يتحوى إلى كل بئر ومراقبة تغير الامتصاص لمدة ساعة واحدة.لمراقبة نقل الإلكترون لغشاء البلازما ، تم استخدام أسكوربات أوكسيديز لمنع تأثيرات الاختزال بوساطة الأسكوربات وتم استخدام ديسموتاز فائق الأكسيد لمنع الاختزال بوساطة الأكسيد الفائق لتحديد أي جزء من تقليل WST-1 كان بسبب كل مكون. مع إضافة أسكوربات أوكسيديز ، تم قمع تقليل WST-1 بحوالي 30٪ مما يشير إلى أن حوالي 30٪ من نقل الإلكترون لغشاء البلازما كان بسبب تصدير الأسكوربات. مع إضافة ديسموتاز الفائق ، تم قمع تقليل WST-1 بحوالي 70٪ مما يشير إلى أن حوالي 70٪ من نقل الإلكترون في غشاء البلازما كان بسبب إطلاق الأكسيد الفائق خارج الخلية.لتحديد ما إذا كان DPIP المنخفض هو ركيزة للأسكوربيت أوكسيديز أو أكسيد ديسموتاز فائق ، تم تقليل مستويات DPIP بحمض الأسكوربيك. بعد 20 دقيقة ، تمت إضافة أسكوربات أوكسيديز ، ومراقبة الامتصاص. يظهر الاسترداد أن DPIP المنخفض هو ركيزة للأسكوربيت أوكسيديز.عندما تمت إضافة أكسيد الفائق ديسموتاز ، تم إعادة أكسدة DPIP أيضا ، وإن كان ذلك بمعدل أبطأ. لذلك ، فإن DPIP المنخفض هو ركيزة لهذه الإنزيمات وليس متقبل إلكترون خارج الخلية مناسبا لاستخدامه مع هذه الإنزيمات. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر جعل جميع الكواشف طازجة كل يوم.بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأكسدة والاختزال لاستكشاف نقل الإلكترون لغشاء البلازما في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس نقل الإلكترون في غشاء البلازما باستخدام مستقبلات الإلكترون خارج الخلية ، وكذلك كيفية تحديد ما إذا كان متقبل الإلكترون قد يكون ركيزة للإنزيمات المستخدمة في الفحص.

measuring-trans-plasma-membrane-electron-transport-by-c2c12-myotubes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

وتقدم وصفا لطريقة لتوصيف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا. ملف الميتوكوندريا ولدت يوفر أربعة معلمات وظيفة الميتوكوندريا التي يمكن قياسها في تجربة واحدة : القاعدية معدل التنفس ، والتنفس ATP المرتبطة ، تسرب بروتون ، وقدرة احتياطية.

الطاقة البيولوجية التجربة الملف باستخدام الخلايا Myoblast C2C12

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم...

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

العضلات الهيكلية هي ضرورية للتنقل وتخزين البروتين الرئيسي هي الهيئات. ووصف القياسات الصحية العضلات داخل C. ايليجانس. ويتم تقييم التغيرات المحتملة في بنية العضلات وظيفة باستخدام GFP المحلية والأصباغ الموجبة.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات C. ايليجانس

يتم وصف طرق لخزعة من الوحشية المتسعة، وإعداد الميتوكوندريا النقى والتنميط respirometric. استخدام حجم العضلات الصغيرة يجعل هذه التقنية مناسبة لتطبيقات البحوث السريرية.

تقييم إعداد وRespirometric من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تحصل عليها عن طريق الجلد إبرة الخزعة

توفر الطرق المقدمة إرشادات خطوة بخطوة لأداء مجموعة من فحوصات قياس التنفس القائمة على الصفيحة الدقيقة باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من كميات قليلة من عضلات الهيكل العظمي للفأر. هذه المقايسات قادرة على قياس التغيرات / التكيفات الميكانيكية في استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا في نموذج حيواني شائع الاستخدام.

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

هنا، نحن نقدم بروتوكولا لدراسة الآلية الجزيئية لبروتون إزفاء عبر الأغشية الدهنية الدهنية واحد، استخدام الفسفرة بو3  كمثال. يمكن الكشف عن الجمع بين كهربية والفحص المجهري الأسفار، تغييرات درجة الحموضة في التجويف حويصلات وحيد، والتي تحتوي على واحد أو إنزيم متعددة، وتحليلها على حدة.

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

وسمح إعداد عينات غنية بالميتوكوندريا من الأنسجة الصلبة المحفوظة المجمدة سابقا للمحققين بإجراء تقييمات وظيفية وتحليلية على حد سواء للميتوكوندريا في مختلف الطرائق التجريبية. توضح هذه الدراسة كيفية إعداد الاستعدادات المخصبة بالميتوكوندريا من أنسجة القلب المجمدة وإجراء تقييمات تحليلية للميتوكوندريا.

قياس مجمعات نقل الإلكترونات الميتوكوندريا في الأنسجة القلبية المجمدة سابقا من ذرية سو: نموذج لتقييم التغيرات في الجيوجيات الحيوية الميتوكوندريا الناجمة عن ممارسة الرياضة

الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الرئيسية التي تظهر مستوى عال من اللدونة الظاهرية في العضلات الهيكلية. استيراد البروتينات من السيتوسول هو مسار حاسم للتكوين الحيوي للعضيات ، وهو ضروري لتوسيع الشبكة والحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا.  لذلك ، فإن استيراد البروتين بمثابة مقياس للصحة الخلوية.

قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

يصف هذا البروتوكول فحصا مقارنا ، باستخدام أنشطة الميتوكوندريا المعقدة CI + CIII و CII + CIII في وجود أو عدم وجود Na + ، لدراسة وجود تجمعات CoQ وظيفية مجزأة جزئيا.

تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا

اكتشف مراقبة نقل الإلكترون عبر غشاء البلازما في الوقت الفعلي باستخدام خلايا C2C12 وتحليل الطيف الضوئي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات التوازن الأكسدة الاختزال في الخلايا الحية.

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

استكشف المزيد من الفيديوهات