التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات بيولوجيا الأوعية الدموية والسرطان ، مثل آليات اللدونة البطانية في مختلف الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الحث القوي ل EndMT في المختبر يتم تحقيقه عن طريق العلاج بالخلايا البطانية TGF-in MS-1. قم أولا بزراعة خلايا MS-1 في ظروف الاستزراع القياسية وتجنب الثقافة من التقاء.

بعد ذلك ، على طبق 10 سم ، اغسل خلايا MS-1 بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. ثم أضف 1 مل من التربسين إلى الطبق واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف 9 مل من وسائط الثقافة إلى الخلايا المثقببة للانفصال.

ثم اجمع معلق الخلية التربسينية في أنبوب سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 إلى 400 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم عداد الخلايا التلقائي لحساب عدد الخلايا القابلة للحياة.

ثم ضع خلايا MS-1 على ألواح استزراع قياسية غير مطلية للثقافة طويلة الأمد. بعد 24 ساعة ، قم بتحفيز الخلايا البطانية بتركيز نهائي قدره 1 نانوغرام لكل مليلتر من TGF-2. ثم احتضان صفيحة الاستزراع عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 48 ساعة من العلاج ، استبدل الوسط بوسط استزراع طازج ودافئ مسبقا يحتوي على TGF-2 لتحليل المصب ، ضع خلايا MS-1 على شريحة غرفة زراعة مكونة من 8 آبار مطلية مسبقا بالجيلاتين. بعد 24 ساعة ، أضف 10 أمتار من مثبطات الصخور إلى مزرعة الخلايا. بعد ساعة ، قم بتحفيز الخلايا البطانية بتركيز نهائي قدره 1 نانوغرام لكل مليلتر من TGF-2.

ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. للحصول على ثقافة مدتها 72 ساعة ، استبدل الوسط القديم بوسط جديد يحتوي على TGF-2 بعد 48 ساعة. بعد يوم كامل من علاج TGF ، قم بإزالة الوسط.

ثم قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد انتهاء فترة التثبيت ، اشطف الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. ثم احتضان الخلايا بنسبة 0.2٪ Triton X-100 لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد خمس دقائق ، اشطف الخلايا مرة أخرى بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ثلاث مرات. بعد ثلاث غسلات ، احتضان الخلايا بالسموم الفلورية المخففة التي تحتوي على عازلة مانعة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، ثلاث مرات.

ثم قم بتلطيخ نوى الخلية باستخدام صبغة ربط الحمض النووي للسيانن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، اشطف الشريحة ، وقم بتركيب زلة غطاء على الشريحة باستخدام وسائط تثبيت المنزلق. راقب الخلايا تحت المجهر متحد البؤر.

تظهر الخلايا إعادة تنظيم ألياف الإجهاد السميكة عند علاج TGF-2. يشير هذا إلى فاعلية TGF-2 في تحفيز EndMT في الخلايا البطانية. بعد 72 ساعة من العلاج TGF-2 ، تخلص من الوسيط وقم بإصلاح الخلايا ب 0.5 إلى 1 مل من 50٪ ميثانول بارد و 50٪ أسيتون لمدة خمس دقائق.

ثم اشطف الخلايا بمحلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات ، ثلاث مرات. بعد اكتمال عمليات الغسيل الثلاث ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية في حجب المخزن المؤقت طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، في الظلام. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرة أخرى بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، ثلاث مرات.

ثم احتضان الخلايا بجسم مضاد ثانوي مترافق بصبغة خضراء ل VE-cadherin في مانع المخزن المؤقت ، لمدة ساعة واحدة في الظلام. اغسل الخلايا مرة أخرى بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، ثلاث مرات. ثم قم بتلطيخ نوى الخلية باستخدام صبغة ربط الحمض النووي للسيانن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد خمس دقائق ، اشطف الشريحة ، وقم بتركيب زلة غطاء على الشريحة باستخدام وسيط تثبيت المنزلق. ثم راقب الخلايا تحت المجهر متحد البؤر. تظهر الخلايا انخفاضا في التعبير عن VE-cadherin, وزيادة التعبير عن الأكتين في العضلات الملساء عند TGF-2 العلاج لمدة 48 إلى 72 ساعة.

قبل فحص تقلص هلام الكولاجين ، قم بزراعة خلايا MS-1 في وجود وعدم وجود TGF-2 لمدة 72 ساعة. ثم تحضير جل الكولاجين من النوع 1 على الثلج. ثم امزج 800 لتر من محلول هلام الكولاجين مع 200 مل من الخلايا البطانية المعالجة ب TGF-2.

بعد ذلك ، أضف 1 مل من هذا الخليط إلى كل بئر من طبق استزراع مكون من 12 بئرا. دع الجل يتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد تصلب الجل ، أضف 1 مل من MEM Alpha ، الذي يحتوي على 10٪ مصل عجل الجنين ، و 50 وحدة لكل مليلتر من البنسلين ، و 50 جم لكل مليلتر من الستربتومايسين ، لتعويم الجل.

ثم افصل الجل عن جدار البئر ، واحتضن الجل العائم عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة من الحضانة ، امسح صور الجل ضوئيا من أسفل اللوحة باستخدام ماسح ضوئي. تظهر التغيرات المورفولوجية المميزة ، مما يؤدي إلى تحويل الخلايا من الحجر المرصوف بالحصى إلى الهندسة المعمارية على شكل مغزل وسيط بسبب التعرض لعلاج TGF-2 لمدة 72 ساعة.

ومن المثير للاهتمام أن علاج TGF beta 2 لمدة 48 إلى 72 ساعة يظهر زيادة في كل من mRNA ومستويات التعبير البروتيني لأكتين العضلات الملساء في خلايا MS-1. يظهر اختبار تقلص الجل أيضا أنه عند علاج TGF-2 ، يتقلص جل الكولاجين من النوع 1 بشكل كبير. ومن المثير للاهتمام أن الحرمان من TGF-2 يقلل من أكتين العضلات الملساء إلى المستوى القاعدي وتستأنف الخلايا مورفولوجيا الحصى ، مما يشير إلى أن EndMT هي عملية ديناميكية.

في الواقع ، فإن تثبيط microRNA 31 بواسطة مثبط LNA microRNA باستخدام خلايا MS-1 ، يخفف من تحريض علامات اللحمة المتوسطة. ومع ذلك ، فإن المثبط لا يؤثر على تحريض الجينات المستهدفة ل TGF مثل Fibronectin 1 و PAI-1 و Smad 7. يمكن إجراء هذا الإجراء كطريقة مثل التعبير الجيني أو الضربة القاضية أو تعديل المصفوفة الدقيقة ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل وظيفة جينية محددة ووظيفة microRNA في EndMT.