جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البنكرياس باستخدام هذه البنكرياس لفهم كيفية تشكل خلايا الغدد الصماء في بيئة معقدة معماريا وخلوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البنكرياس تطور خلايا الغدد الصماء بسبب إدراج اللحمة المتوسطة المحيطة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن البنكرياس صغير جدا عند e10.5.

والتشريح أمر بالغ الأهمية لتكوين البنكرياس للحصول على ما يكفي من الأنسجة غير الملوثة. للتحضير للتشريح ، املأ دلوا ثلج وضع وعاءا من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في الجليد. نظف ملقطين ذوي أطراف دقيقة ومقص تشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بالقرب من منطقة التشريح ، ضع حاوية بها ثلاثة أنابيب شعرية على الأقل من البورسليكات ، وأخف وزنا ، وأطراف ماصة 1000 ميكرولتر مفلترة. بعد ذلك ، قم بسحب مليلتر واحد على الأقل من 1.25 ملليغرام لكل مليلتر من البارد المخفف في ماء معقم في البئر الثاني من صفيحة مكونة من 12 بئرا على الجليد. Pipet PBS في الآبار الأولى والثالثة والرابعة من اللوحة المكونة من 12 بئرا.

أيضا ، ماصة مليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين في أنبوب 1.5 مليلتر على الجليد. بعد القتل الرحيم للفئران الحامل e10.5 الموقوتة وفقا لإرشادات IACUC ، رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول لتنظيف المنطقة. بعد ذلك ، قم بعمل شق على شكل حرف V في المنطقة التناسلية للفأر باستخدام المقص والملقط واستمر في الشق حتى الحجاب

استئصال الرحم بعناية عن طريق عمل شق في الأجزاء الجانبية العلوية من الرحم ، وسحب العضو لأعلى بعيدا عن الفأر واتباع هذا الشق وصولا إلى منطقة الأعضاء التناسلية قبل التكرار على الجانب الآخر. ضع الرحم المستأصل في طبق بتري بطول 10 سم مع PBS البارد. تحت مجهر التشريح الخفيف ، ضع طبق بتري وافتح أنسجة الرحم بعناية عن طريق وضع ملقطين بين كل جنين وأنسجة تقشير بعيدا عن كيس الصفار.

انقل الأجنة عن طريق الإمساك بكيس الصفار برفق باستخدام الملقط ووضعها في طبق بتري بطول 10 سم مع PBS طازج وبارد. ضع طبق بتري على الثلج. بعد ذلك ، ضع عدة قطرات PBS على غطاء طبق بتري الذي يبلغ طوله 10 سم.

استخدم هذه القطرات لنقل الجنين أثناء التشريح حيث تتم إزالة الأنسجة خارج الجنين لضمان الرؤية. انقل الجنين إلى قطرة PBS وقم بإزالته برفق من كيس الصفار باستخدام الملقط بينما تبقى الأجنة المتبقية في PBS على الجليد. قم بإزالة الرأس قبل نقل الجنين إلى قطرة PBS جديدة باستخدام ملقط لغرف الجنين برفق دون الإضرار بالأنسجة.

في قطرة PBS جديدة ، قم بإزالة براعم الأطراف الأربعة باستخدام الملقط. ضع الملقط في الفتحة حيث كان برعم الطرف موجودا وقم بتمزيق الأنسجة الخارجية فقط في الأمام. قم بتدوير الجنين وكرر ذلك في الاتجاه الخلفي ، والتوقف عند برعم الطرف الخلفي.

في هذه المرحلة ، يجب أن يكون الجهاز الهضمي مرئيا. المنطقة الخلفية من الجهاز الهضمي لها انحناء طفيف. أدخل ملقطا خلف هذا الانحناء في الفتحة بين الجهاز الهضمي ومنطقة العمود الفقري عند جدار الجسم. افصل الجهاز الهضمي ، واعمل ببطء لأعلى حتى يتم الوصول إلى المنطقة الأمامية ، حيث تتصل منطقة القلب.

في الخطوات التالية ، من الأهمية بمكان تجنب الأنسجة المحيطة في الثقافة ، حتى لا تلوث البنكرياس بالأنسجة غير البنكرياسية. ومع ذلك ، إذا لم تمسك برعم البنكرياس بالكامل ، فسوف يضعف عدد وحجم البنكرياس. انقل الجهاز الهضمي إلى قطرة PBS الطازجة.

استمر في إزالة الأنسجة الخارجية المحيطة بالجهاز الهضمي. بمجرد إزالة هذا النسيج الخارجي ، يمكن تصور برعم البنكرياس خلف براعم الكبد ، بين المعدة والأمعاء. بعد ذلك ، خذ الملقط واضغط برفق على الأنسجة الموجودة أسفل البرعم البارز في الأمعاء وارفع برعم البنكرياس قليلا.

بعد الضغط على المنطقة التي يتصل فيها البرعم بالأمعاء ، يتم فصل البرعم. اغسل مرة واحدة في فقاعة PBS جديدة قبل نقل البرعم إلى البئر الأول من اللوحة المكونة من 12 بئرا و PBS البارد على الجليد. كرر حتى يتم جمع كل البراعم من الأجنة ووضعها في البئر الأول من اللوحة المكونة من 12 بئرا.

بعد ذلك ، ضع طبق 12 جيدا تحت مجهر تشريح الضوء. احسب عدد براعم البنكرياس التي تم تشريحها بنجاح لحساب نسبة الانقسام لاحقا. ضع طرف ماصة 1000 ميكرولتر مفلتر في الماصة مع توصيل الأنبوب الشعري.

تعقيم الأنبوب الشعري باللهب وإنشاء انحناء في الأنبوب لسهولة الاستخدام. استخدم الشعيرات الدموية لنقل البراعم إلى البئر الثاني الذي يحتوي على محلول التباعد البارد لمدة دقيقتين قبل نقلها إلى البئر الثالث الذي يحتوي على PBS نظيف. قم بتحريك البراعم لأعلى ولأسفل ونقلها إلى البئر الرابع الذي يحتوي على PBS نظيف.

أخيرا ، باستخدام الجهاز الشعري ، انقل البراعم إلى أنبوب 1.5 مليلتر مع 0.05٪ تريبسين. ضع الأنبوب في شاكر 37 درجة مئوية الدافئ مسبقا ورجه عند 1,500 دورة في الدقيقة لمدة أربع إلى خمس دقائق. بعد الدوامة لمدة 10 ثوان تقريبا ، ضع الأنبوب على الفور في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران لمدة خمس دقائق عند 200 جرام.

قم بإزالة جميع المحلول باستثناء حوالي 50 ميكرولترا بحذر حتى لا تزعج الخلايا ذات الطرد المركزي. لكل برعم تم جمعه في 400 ميكرولتر من وسائط تكوين الأعضاء إلى خلايا الطرد المركزي ، دوامة النبض ثلاث مرات ولوحة 100 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 96 بئر منخفضة التعلق ، وتقسيم البراعم بنسبة واحد إلى أربعة. تحقق تحت المجهر لتصور الخلايا المنفصلة تطفو بحرية.

ثم ضع طبق الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون على الروك بسرعة متوسطة. يجب أن يؤدي التشريح الدقيق لأجنة الفئران عند e10.5 من القرن الرحمي إلى إنتاج أجنة غير تالفة في PBS لمزيد من التشريح. يمكن إزالة الجهاز الهضمي بكفاءة من الجنين ، مما يسمح بتمييز برعم البنكرياس الظهري عند تقاطع الأمعاء والمعدة.

في وسائط تكوين الأعضاء ، تتجمع هذه الخلايا الخالية من السقالات العائمة ذاتيا وتنظم في بنكرياس ثلاثي الأبعاد تنمو وتستمر لمدة 10 أيام على الأقل في المزرعة. يؤدي تطبيق منشط بروتين كيناز سي بتركيزات عالية إلى تغيير مورفولوجيا البنكرياتويدات النامية ، مما يؤدي إلى وجود خلايا ظهارية مرتبطة بشكل فضفاض وزيادة التفرع. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استخدام المعدلة وراثيا بتصور الخلايا أثناء تمايزها في الوقت الفعلي.

لتقييم ارتباط أنسجة اللحمة المتوسطة البنكرياسية بالخلايا الظهارية للبنكرياس ، يمكن إجراء التلوين المناعي لعلامات كل نسيج. يكشف التلوين المناعي لعلامة القناة بعلامة الغدد الصماء والنوى عن تكوين متعدد الأنساب في البنكرياس. تظهر علامة اللحمة المتوسطة الملطخة بالاشتراك مع علامة سلف البنكرياس أن اللحمة المتوسطة تغلف البنكرياس.

يتم الكشف عن تطور الخلايا البيتا عن طريق تلطيخ العلامة الظهارية وعلامة خلية بيتا. باستخدام التحليل الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، يمكن تقييم نصوص الأسلاف والخلايا المتمايزة ، مثل جينات السلف والعلامات المتمايزة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعة واحدة تقريبا ، بما في ذلك وقت التحضير ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التشريح للحصول على أنسجة البنكرياس من 10.5 فأر لتوليد البنكرياس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إزالة الجهاز الهضمي بعناية من الأجنة ، وإلا فسيكون من الصعب جدا العثور على برعم البنكرياس. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل GSIS و ELISA من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كمية الأنسولين أو ببتيد C التي يتم إنتاجها بعد تحفيز الجلوكوز.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لنا لاستكشاف العواقب المورفولوجية لتنشيط PKC باستخدام جزيئات صغيرة. طريقة لمواصلة تنفيذ هذا النظام لدراسة تأثير عامل النسخ للتعبير وحتى لإجراء تجارب الرعاف المهمة.