Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

الهدف العام من هذه التقنية هو دراسة مشاركة mRNA الفردية مع polysomes أثناء الترجمة. التنميط متعدد الجسيمات هو تقنية قوية لدراسة تفاعل mRNA مع الريبوسومات والبوليسومات. هذه التقنية مهمة لدراسات تنظيم تخليق البروتين وتنشيط الترجمة والقمع.

يقدم فريقنا هنا تقنيات التجزئة متعددة الأجسام ، وتحليل الكسور على سبيل المثال لثلاثة كائنات حية. الطفيلي الليشمانيا الكبرى ، والخلايا البشرية المستنبتة ، والأنسجة الحيوانية. يتكون هذا النهج من أربع خطوات رئيسية ، تحضير المحللة ، وإعداد تدرج السكروز والطرد المركزي الفائق ، وتجزئة البوليسوم ، وجمع العينات.

تحليل الكسور. يتم جمع الخلايا من مصادر مختلفة وغسلها وتحللها في محلول التحلل عن طريق المرور عبر إبرة أو الخالط Dounce. يستخدم الطرد المركزي لإزالة بقايا الخلية التي توضح المحلل.

يتكون تدرج السكروز المستمر عن طريق خلط محاليل السكروز بنسبة 10٪ و 50٪ في صانع التدرج. يتم تحميل Lysate في الجزء العلوي من التدرج. يفصل الطرد المركزي الفائق بين mRNA المرتبطة بعدد مختلف من الريبوسومات.

والتي تتم مراقبتها بواسطة كاشف الأشعة فوق البنفسجية أثناء التجزئة ، وتشكيل أطياف ماصة مميزة. تحضير المحللة. هناك بعض الاختلافات في تحضير المحللة اعتمادا على المصدر.

بعد تحضير المحللة ، تكون الإجراءات متطابقة بغض النظر عن أصل العينة. تحضير الليشمانيا الكبرى لليزات السيتوبلازمية. ضع خلايا الليشمانيا الرئيسية في 30 مليلتر من الوسط بكثافة 100،000 خلية لكل مليلتر.

يتم إجراء هذه الخطوة في خزانة السلامة البيولوجية. ضع القارورة مع مزرعة الليشمانيا في الحاضنة وقم بزراعة الخلايا عند 27 درجة مئوية ، حتى المرحلة اللوغاريتمية. عادة ما يستغرق الأمر حوالي يومين لينمو.

يمكن رؤية الخلايا الرئيسية لمرض الليشمانيا بسهولة تحت المجهر. أضف Cycloheximide إلى مزرعة الليشمانيا المزروعة إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكروغرام لكل ملليلتر ، لإيقاف الريبوسومات على mRNAs المترجمة. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة عشر دقائق عند 27 درجة مئوية.

بعد اكتمال العلاج ب cycloheximide ، قم بنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بتدويرها 1 ، 800 جم لمدة 8 دقائق. تجاهل المادة الطافية. اغسل الخلايا ب 30 مليلتر من الرصاص وأجهزة الطرد المركزي.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من الرصاص. خذ كمية من الخلايا واخلطها مع محلول الفورمالديهايد. ثم عد الخلايا عن طريق مقياس كثافة الدم.

نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب ميكروفوج. قم بتدوير الخلايا عند 1 ، 800 جم لمدة 8 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من الطافف.

أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من محلول التحلل الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والحمض النووي الريبي (RNAsin). مرر الخلايا عبر إبرة قياس 23 ثلاث مرات. بعد المرور عبر الإبرة ، يصبح المحلل شفافا.

جهاز طرد مركزي عند 11 ، 200 جم لمدة عشر دقائق عند أربع درجات مئوية لتوضيح المحللة. انقل المحللة المصفاة إلى أنبوب ميكروفيوج جديد واحتفظ بها على الجليد حتى تدرج السكروز الطرد المركزي الفائق. تحضير المحللة السيتوبلازمية من الخلايا البشرية المستنبتة.

قم بزراعة خلايا HeLa في طبق كبير في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO2. أضف cycloheximide إلى خلايا HeLa المزروعة إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكروغرام لكل مليلتر لإيقاف الريبوسومات على mRNA المترجمة. احتضان الخلايا لمدة عشر دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

استنشق متوسط واغسل الطبق على الثلج مرتين باستخدام الرصاص البارد. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل إلى اللوحة واكشط الخلايا. انقل الخلايا المحللة إلى أنبوب الطرد الدقيق.

مرر الخلايا عبر إبرة قياس 23 ثلاث مرات. تدور في 11 ، 200 جم لمدة ثماني دقائق لتوضيح المحللة. بعد الطرد المركزي ، حرك الأنابيب على الجليد ، وانقل المادة الطافية إلى الأنبوب الجديد.

خذ حصة ، وقم بتخفيفها ، وقياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام قطرة نانو. إذا كانت هناك عينات متعددة ، فاضبط المحللات على نفس الكثافة البصرية واحتفظ بالعينات على الجليد حتى الطرد المركزي الفائق المتدرج للسكروز. تحضير المحللة السيتوبلازمية من خصية الفأر.

تشريح خصية الفأر. قم بعمل شق صغير في الغلالة البيضاء واجمع الأنابيب المنوية للخصية وانقلها في الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من الرصاص. امزج الأنسجة بقوة.

واترك الأنسجة تستقر على الجليد لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت واغسله ب pbs مرتين أخريين. انقل الأنابيب المنوية في أنبوب ملليلتر وقم بتدويرها عند 500 جم لمدة دقيقة واحدة.

قم بإزالة المادة الطافية. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الأنابيب واستخدم ماصة لتعطيل الأنسجة. انقل التعليق إلى خالط حجم صغير.

قم بتعطيل الأنسجة بسبع إلى ثماني ضربات من المدقة الزجاجية. انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي صغير. قم بالطرد المركزي للعينة عند 12،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة ثماني دقائق لمسح المحللة.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد واحتفظ بها على الجليد. ثم استمر في إعداد التدرج السكروز. تحضير التدرج السكروز.

ضع أنبوب طرد مركزي فائق في الكتلة الدقيقة وارسم الخط على طول المستوى العلوي من الكتلة. ثم انقل الأنبوب إلى رف ثابت. خذ حقنة سعة عشرة ملليلتر ، مع توصيل جهاز الطبقات واملأ المحقنة بمحلول سكروز بنسبة 10٪.

حرره برفق في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق حتى يصل محلول السكروز إلى العلامة. املأ حقنة أخرى بمحلول السكروز بنسبة 50٪ وأدخل جهاز الطبقات الخاص بها بعناية من خلال طبقة السكروز بنسبة 10٪ في قاع الأنبوب. حرر محلول السكروز برفق ، بدءا من الأسفل حتى يصل إلى العلامة الموجودة على الأنبوب.

ثم أغلق الأنبوب بغطاء مرفق. لتحضير تدرج السكروز ، قم بتشغيل جهاز صانع التدرج. ثم قم بتسوية اللوحة باستخدام الأزرار لأعلى أو لأسفل واضغط على تم.

بعد تسوية اللوحة الصحافة grad. انتقل إلى قائمة قائمة التدرج وحدد الدوار SW41. ثم اختر تدرج السكروز المطلوب.

اضغط على الاستخدام. ضع حامل أنبوب قاعدة المغناطيس على صانع التدرج. ثم انقل الأنبوب إلى الحامل.

يمكن تحضير ما يصل إلى ستة تدرجات في نفس الوقت. اضغط على تشغيل. يقوم صانع التدرج بتدوير الأنابيب بسرعة وزوايا البرنامج ، مما يشكل تدرجا خطيا.

سوف يستغرق الأمر بضع دقائق فقط لتحضير التدرج. عند اكتمال العملية ، ضع الأنبوب في الرف. قم بإزالة الحجم ، بما يعادل حجم العينة من أعلى أنابيب الطرد المركزي الفائق مع تدرجات السكروز.

قم بتحميل 500 ميكرولتر من المحللة بعناية في الأعلى. ضع الأنابيب في دلاء الدوار وقم بموازنتها. جهاز طرد مركزي عند 260،000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.

تجزئة متعددة الأشكال وجمع العينات. بعد الطرد المركزي الفائق ، ضع الأنابيب في دلاء الدوار على الجليد. قم بتشغيل مجمع الكسور والمجزأ.

انقر فوق مسح ضوئي في قائمة المجزأة. ضع رفا به أنابيب تجميع في مجمع الكسر. املأ خزان الشطف على جانب المجزأ بالماء منزوع الأيونات.

اضغط على مفتاح الشطف لمدة عشر ثوان لشطف المضخة. قم بتوصيل محول الشطف مع المحقنة المملوءة بالماء بالمكبس للمعايرة. افتح برنامج التجزئة على الكمبيوتر.

اضغط على معايرة. استخدم الإعداد الافتراضي واضغط على Ok.Be جاهز لحقن الماء من المحقنة. اضغط على موافق لإجراء المعايرة.

ابدأ على الفور في حقن الماء لمدة خمس ثوان قادمة. ستظهر علامة اكتمال المعايرة الصفرية . قم بإزالة محول الشطف مع المحقنة وقم بتوصيل طرف بمكبس المجزأ.

افتح صمام الهواء النحاسي واضغط على مفتاح الهواء لمدة عشر ثوان لتجفيف أنابيب الهواء وخلية التدفق. أغلق صمام الهواء. خذ أنبوب التدرج من دلو الدوار وضعه في الرف.

ضع غطاء حامل الأنبوب على الجزء العلوي من الأنبوب ، وحرك الأنبوب بعناية إلى حامل الأنبوب وقفله. ضع الحامل تحت المكبس. في كثير من الأحيان ، يمكن رؤية العصابات متعددة الجذور بالعين.

قدم الإعدادات المطلوبة لأعداد الكسور والحجم. قم بتسمية الملف واضغط على موافق ، ثم انتقل إلى زر الرسم البياني. في النافذة التالية اضغط على بدء المسح.

ستظهر الإعدادات ، واضغط على موافق.سينتقل المجمع من الحضيض إلى الكسر الأول ، وسيتحرك المكبس إلى الأنبوب. عندما يصل المكبس إلى قمة التدرج ، فسوف يتباطأ إلى السرعة المحددة ، وسيتم جمع الكسور. عادة ، نجمع 24 جزءا بحجم 500 ميكرولتر لكل منهما.

عند الانتهاء ، سيتحرك المكبس خارج أنبوب التدرج. افتح صمام الهواء النحاسي. اضغط على مفتاح الهواء على المجزأ لاسترداد الكسر الأخير.

في نهاية الجري سترى ملف تعريف امتصاص التدرج. تحليل الكسور. يمكن استخدام الكسور التي تم الحصول عليها لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتين.

يمكن تحليل الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي متبوعا ب Northern Blot أو استخدامه لإنتاج (كدنا) ، متبوعا بتفاعل RT-qPCR لتحليل ارتباط الرنا المرسال الفردي مع البوليسومات. يمكن استخدام تسلسل الجيل التالي لتحليل الحالة الانتقالية ل mRNA على مقياس النسخ. لتحليل البروتين للكسور متعددة الدولارات ، يتم ترسيب البروتينات بحمض ثلاثي العرق لتركيزها.

ثم يتم تحليل البروتينات بواسطة Western Blotting ، أو عن طريق Mass Spec على مستوى البروتين. النتائج. نقدم هنا نتائج تجزئة متعددة الأشكال وتحليلها على أمثلة ثلاثة كائنات حية. الليشمانيا والخلايا البشرية المستنبتة وأنسجة الفئران.

تم استخدام تجزئة متعدد الأشكال لدراسة ارتباط شيرب وتوبولين mRNA بالريبوسومات أثناء الترجمة والليشمانيا الكبرى. الرسم البياني للامتصاص للتجزئة له شكل مميز مع قمم نموذجية للوحدات الفرعية للريبوسوم 40S و 60S ، والأحاديات 80S ، ومتعددة الجسيمات. تم دمج الأجزاء من الكسور في ثلاث مجموعات.

ما قبل البوليسومات ، والبوليسومات الخفيفة ، والبوليسومات الثقيلة. تمت دراسة المستويات النسبية ل mRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. تشير البيانات إلى أن Tubulin mRNA تتم ترجمته بنشاط.

حيث كان يرتبط في الغالب بالجسيمات الثقيلة والخفيفة. في حين أن ترجمة شيرب mRNA أقل نشاطا. تم العثور عليه في الغالب بالاشتراك مع البوليزومات اللاحقة والبوليسومات الخفيفة.

وبالتالي ، توضح هذه التجربة بوضوح قدرة التقنية على دراسة مشاركة mRNA الفردية في الترجمة. يقدم هذا الشكل رسما بيانيا نموذجيا للامتصاص لتجزئة خلايا HeLa متعددة الأطوار. تتركز البروتينات عن طريق الترسيب مع 10٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك.

الكشف عن البروتين الريبوسومي للوحدة الفرعية الصغيرة RPS6 ، والبروتين الريبوسومي للوحدة الفرعية الكبيرة RPL11 بواسطة Western Blot. يرتبط توزيعها بشكل جيد مع القمم المميزة ، على طيف الامتصاص. في هذا الشكل ، نقدم مثالا على اكتشاف الحمض النووي الريبي الريبوسومي عن طريق الرحلان الكهربائي في البوليسومات المجزأة من خصية الفأر. الاستنتاجات.

التنميط متعدد الأشكال هو تقنية متعددة الاستخدامات ، يمكن استخدامها لتحليل الحالة الانتقالية للرنا المرسال الفردية ، وفحص البروتينات المرتبطة بالريبوسوم ، ودراسة التنظيم الانتقالي في الكائنات الحية النموذجية المختلفة في ظل ظروف مختلفة.