نموذج في المختبر لدراسة أثر "العلاج الضوئي" 5-Aminolevulinic حمض-بوساطة على بيوفيلم العنقوديات الذهبية

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم التأثير المضاد للميكروبات لحمض أمينوليفولينيك الخمسة أو العلاج الضوئي الديناميكي بوساطة ALA على المكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية. يمكن أن تجيب هذه الطريقة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأغشية الحيوية البكتيرية حول كيفية استخدام إصلاح الخلايا الضوئية كعلاج بديل للسيطرة على التهابات الأغشية الحيوية. تتمثل إحدى مزايا هذا الإجراء في أنه من المحتمل استخدامه للبكتيريا الأخرى بأقل قدر من التعديل.

لتوليد غشاء حيوي في صفيحة 96 بئر ، قم أولا بتلقيح واحد ناقص 80 درجة مئوية ThOD المكورات العنقودية الذهبية الولايات المتحدة الأمريكية ثلاثمائة في ثلاثة أغشية حيوية تشكل ثقافات سلالة سريرية في أنابيب فردية مستديرة القاع سعة 14 مليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من مرق الصويا التربتون ، أو TSB ، متوسط ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بين عشية وضحاها. عندما تصل الثقافات إلى مرحلة ثابتة ، قم بالطرد المركزي للخلايا البكتيرية وأعد تعليق الكريات و PBS إلى اثنين في 10 إلى المستعمرة التاسعة التي تشكل وحدة لكل تركيز مليلتر. تمييع هذه المعلقات البكتيرية بنسبة واحد إلى 200 ووسط TSB مكمل بصفر نقطة خمسة في المائة من الجلوكوز وبذور 200 ميكرولتر من الخلايا البكتيرية لكل بئر في ثلاثة آبار لكل سلالة لكل مجموعة تجريبية في زراعة خلايا البوليسترين المعالجة 96 صفيحة دقيقة بئر لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، بالأكسجين ، دون اهتزاز.

في اليوم التالي ، اغسل الآبار برفق ثلاث مرات باستخدام PBS دون إزعاج الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من ALA المحضرة حديثا إلى الآبار التجريبية المناسبة ، وضع اللوحة على حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. ثم قم بإشعاع اللوحة بصمام ثنائي باعث للضوء بقوة ضوء 100 مللي واط لكل سنتيمتر مربع لمدة ساعة واحدة.

لحساب عدد البكتيريا القابلة للحياة لكل مجموعة في نهاية العلاج بالضوء ، اغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي خلايا غير ملتصقة. ثم استخدم طرف ماصة لكشط البكتيريا الملتصقة من قاع كل بئر. اسحب الخلايا من كل مجموعة إلى أنبوب eppendorf واحد لكل حالة تجريبية وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من 0.25 في المائة من إنزيم البنكرياتين و PBS لمدة 90 دقيقة حضانة عند 37 درجة مئوية ، متبوعا بطرد مركزي آخر. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS وقم بعمل واحد إلى 10 تخفيفات متسلسلة لكل مجموعة ، مع إضافة خمسة ميكرولترات من العينة المخففة بشكل متسلسل على ألواح أجار الصويا الفردية من التربتون. ثم احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة واحسب عدد المستعمرات البكتيرية لكل مجموعة.

لتقييم الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ، قم بتوليد وإشعاع الأغشية الحيوية كما هو موضح. اغسل الأغشية الحيوية المشعة باستخدام PBS وصمة عار الخلايا الحية والميتة بمليلتر واحد من صبغة نفاذية لغشاء الخلية الفلورية والكروموسومية الخضراء ومليلتر واحد من يوديد البروبيديوم الميكرومولار ، على التوالي. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة البقعة الزائدة وتصوير الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر تحت عدسة موضوعية غمر بالزيت 63 مرة 1.4 NA.

تنخفض قابلية بقاء بكتيريا الأغشية الحيوية بعد العلاج المزدوج بالضوء ALA مقارنة بقابلية بكتيريا الأغشية الحيوية الفردية أو غير المعالجة وجميع السلالات الأربع التي تم اختبارها. يؤكد تصور الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر هذه النتيجة ، حيث لوحظت معظم الخلايا الإيجابية ليوديد البروبيديوم في مجموعة العلاج المزدوج للعلاج بالضوء ALA. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن معالجة البكتيريا المعالجة ب ALA بالكامل يجب أن يتم في الظلام ، ويجب التعامل مع الأغشية الحيوية للمادة برفق لتجنب إزعاج الأغشية الحيوية المكونة.

يمكن تطبيق هذه الرسالة لاستكشاف التأثير المضاد للميكروبات للعلاج الضوئي الديناميكي على الأغشية الحيوية البكتيرية في المختبر من قبل الباحثين في مجال العدوى البكتيرية.