نموذج في المختبر لدراسة أثر "العلاج الضوئي" 5-Aminolevulinic حمض-بوساطة على بيوفيلم العنقوديات الذهبية
أبريل 16, 2018
ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لدراسة تأثير مضادات الميكروبات 5-aminolevulinic حمض بوساطة العلاج الضوئي (علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي) في بيوفيلم العنقوديات الذهبية . يمكن استخدام هذا البروتوكول لتطوير نموذج في المختبر لدراسة علاج الأغشية الحيوية البكتيرية مع التوقيت الصيفي الباسفيكي في المستقبل.
الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم التأثير المضاد للميكروبات لحمض أمينوليفولينيك الخمسة أو العلاج الضوئي الديناميكي بوساطة ALA على المكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية. يمكن أن تجيب هذه الطريقة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأغشية الحيوية البكتيرية حول كيفية استخدام إصلاح الخلايا الضوئية كعلاج بديل للسيطرة على التهابات الأغشية الحيوية. تتمثل إحدى مزايا هذا الإجراء في أنه من المحتمل استخدامه للبكتيريا الأخرى بأقل قدر من التعديل.
لتوليد غشاء حيوي في صفيحة 96 بئر ، قم أولا بتلقيح واحد ناقص 80 درجة مئوية ThOD المكورات العنقودية الذهبية الولايات المتحدة الأمريكية ثلاثمائة في ثلاثة أغشية حيوية تشكل ثقافات سلالة سريرية في أنابيب فردية مستديرة القاع سعة 14 مليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من مرق الصويا التربتون ، أو TSB ، متوسط ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بين عشية وضحاها. عندما تصل الثقافات إلى مرحلة ثابتة ، قم بالطرد المركزي للخلايا البكتيرية وأعد تعليق الكريات و PBS إلى اثنين في 10 إلى المستعمرة التاسعة التي تشكل وحدة لكل تركيز مليلتر. تمييع هذه المعلقات البكتيرية بنسبة واحد إلى 200 ووسط TSB مكمل بصفر نقطة خمسة في المائة من الجلوكوز وبذور 200 ميكرولتر من الخلايا البكتيرية لكل بئر في ثلاثة آبار لكل سلالة لكل مجموعة تجريبية في زراعة خلايا البوليسترين المعالجة 96 صفيحة دقيقة بئر لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، بالأكسجين ، دون اهتزاز.
في اليوم التالي ، اغسل الآبار برفق ثلاث مرات باستخدام PBS دون إزعاج الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من ALA المحضرة حديثا إلى الآبار التجريبية المناسبة ، وضع اللوحة على حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. ثم قم بإشعاع اللوحة بصمام ثنائي باعث للضوء بقوة ضوء 100 مللي واط لكل سنتيمتر مربع لمدة ساعة واحدة.
لحساب عدد البكتيريا القابلة للحياة لكل مجموعة في نهاية العلاج بالضوء ، اغسل كل بئر برفق ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي خلايا غير ملتصقة. ثم استخدم طرف ماصة لكشط البكتيريا الملتصقة من قاع كل بئر. اسحب الخلايا من كل مجموعة إلى أنبوب eppendorf واحد لكل حالة تجريبية وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من 0.25 في المائة من إنزيم البنكرياتين و PBS لمدة 90 دقيقة حضانة عند 37 درجة مئوية ، متبوعا بطرد مركزي آخر. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS وقم بعمل واحد إلى 10 تخفيفات متسلسلة لكل مجموعة ، مع إضافة خمسة ميكرولترات من العينة المخففة بشكل متسلسل على ألواح أجار الصويا الفردية من التربتون. ثم احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة واحسب عدد المستعمرات البكتيرية لكل مجموعة.
لتقييم الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ، قم بتوليد وإشعاع الأغشية الحيوية كما هو موضح. اغسل الأغشية الحيوية المشعة باستخدام PBS وصمة عار الخلايا الحية والميتة بمليلتر واحد من صبغة نفاذية لغشاء الخلية الفلورية والكروموسومية الخضراء ومليلتر واحد من يوديد البروبيديوم الميكرومولار ، على التوالي. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة البقعة الزائدة وتصوير الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر تحت عدسة موضوعية غمر بالزيت 63 مرة 1.4 NA.
تنخفض قابلية بقاء بكتيريا الأغشية الحيوية بعد العلاج المزدوج بالضوء ALA مقارنة بقابلية بكتيريا الأغشية الحيوية الفردية أو غير المعالجة وجميع السلالات الأربع التي تم اختبارها. يؤكد تصور الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر هذه النتيجة ، حيث لوحظت معظم الخلايا الإيجابية ليوديد البروبيديوم في مجموعة العلاج المزدوج للعلاج بالضوء ALA. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن معالجة البكتيريا المعالجة ب ALA بالكامل يجب أن يتم في الظلام ، ويجب التعامل مع الأغشية الحيوية للمادة برفق لتجنب إزعاج الأغشية الحيوية المكونة.
يمكن تطبيق هذه الرسالة لاستكشاف التأثير المضاد للميكروبات للعلاج الضوئي الديناميكي على الأغشية الحيوية البكتيرية في المختبر من قبل الباحثين في مجال العدوى البكتيرية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً لدراسة التأثير المضاد للميكروبات للعلاج الديناميكي الضوئي بوساطة حمض 5-أمينوليفولينيك (ALA-PDT) على الغشاء الحيوي لبكتيريا Staphylococcus aureus. ويمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الأغشية الحيوية البكتيرية فيما يتعلق بالعلاجات البديلة للسيطرة على عدوى الغشاء الحيوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- العلاج الضوئي الديناميكي
- أبحاث الغشاء الحيوي
خلفية علمية
- تُعد بكتيريا Staphylococcus aureus ممرضاً شائعاً يرتبط بالعدوى الناجمة عن الأغشية الحيوية.
- العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو علاج يستخدم مركبات يتم تنشيطها بالضوء للقضاء على البكتيريا.
- يُعد حمض 5-أمينوليفولينيك (ALA) طليعة في تخليق المحسسات الضوئية المستخدمة في العلاج الضوئي الديناميكي (PDT).
- تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نموذج في المختبر (in vitro) لاختبار فعالية العلاج الضوئي الديناميكي باستخدام حمض (ALA-PDT) على الأغشية الحيوية البكتيرية.
الغرض من الدراسة
- لتقييم التأثير المضاد للميكروبات للعلاج الضوئي الديناميكي (PDT) بوساطة ALA على الأغشية الحيوية لبكتيريا Staphylococcus aureus.
- لاستكشاف إمكانية استخدام العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) كعلاج بديل لإصابات الأغشية الحيوية.
- لوضع بروتوكول يمكن تكييفه لسلالات بكتيرية أخرى.
الطرق المستخدمة
- تلقيح بكتيريا Staphylococcus aureus في مرق تريبتون صويا (TSB) لتكوين الأغشية الحيوية.
- تحضين المزارع عند 37 degrees Celsius للوصول إلى طور الثبات.
- طرد مركزي وإعادة تعليق الخلايا البكتيرية في PBS.
- استزراع الخلايا البكتيرية في لوح دقيق يحتوي على 96 بئراً للعلاج بـ PDT.
النتائج الرئيسية
- ينجح هذا البروتوكول في إنشاء أغشية حيوية مناسبة لاختبار العلاج الضوئي الديناميكي باستخدام حمض أمينوليفولينيك (ALA-PDT).
- أظهر العلاج الضوئي الديناميكي باستخدام حمض أمينوليفولينيك (ALA-PDT) تأثيرات محتملة مضادة للميكروبات ضد الأغشية الحيوية لبكتيريا Staphylococcus aureus.
- يمكن تطويع هذه الطريقة لسلالات بكتيرية أخرى مع إجراء تعديلات طفيفة.
- هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحسين ظروف العلاج.
الاستنتاجات
- يعد العلاج الضوئي الديناميكي باستخدام حمض أمينوليفولينيك (ALA-PDT) نهجاً واعداً لعلاج الأغشية الحيوية البكتيرية.
- توفر هذه الدراسة أساساً للأبحاث المستقبلية في مجال العلاج الضوئي الديناميكي.
- إن فهم آليات العلاج الضوئي الديناميكي يمكن أن يؤدي إلى تحسين استراتيجيات علاج العدوى المرتبطة بالأغشية الحيوية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح هذا النموذج المختبري التقييم الآلي للعلاج الضوئي الديناميكي (PDT) للعدوى المرتبطة بالغشاء الحيوي، والتي تمثل تحدياً متزايداً في تطوير مضادات الميكروبات. ومن خلال قياس الوحدات المكونة للمستعمرات وتصوير الحيوية عبر المجهر البؤري، يوفر هذا الفحص نتائج كمية قابلة للتكرار لتقليل المخاطر المرتبطة بمرشحات العلاج الضوئي الديناميكي في مراحل الاكتشاف المبكرة. وتدعم هذه المنصة التحقق من الأهداف وتحديد المركبات الرائدة لاستراتيجيات مكافحة الغشاء الحيوي، وهي ذات أهمية خاصة لبكتيريا Staphylococcus aureus ومسببات الأمراض الأخرى المكونة للغشاء الحيوي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يستقصي الفرضية العلاجية لفعالية العلاج الضوئي الديناميكي باستخدام حمض أمينوليفولينيك (ALA-PDT) ضد الأغشية الحيوية لبكتيريا S. aureus من خلال خفض عدد الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU) وتلوين الحيوية.
- القيمة التشغيلية: يتيح التحقق الوظيفي من الهدف من خلال ربط تنشيط المُحسّس الضوئي بآليات القتل البكتيري في نموذج غشاء حيوي مضبوط.
- القيمة التنبؤية: يدعم قرارات المضي قدماً من عدمه في المرحلة قبل السريرية من خلال إثبات التأثيرات المضادة للميكروبات المعتمدة على الجرعة والوقت في ظل ظروف قياسية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد أغشية حيوية ناضجة وقابلة للتكرار من بكتيريا S. aureus في تنسيق 96 بئر، وهو ما يناسب الفحص عالي الإنتاجية لمركبات PDT.
- المخرجات الكمية: توفر تعدادات CFU وبيانات المجهر البؤري كقراءات متعامدة لتقييم فعالية المركبات ومدى اختراق الغشاء الحيوي.
- إعادة استخدام المنصة: قابلة للتكيف مع سلالات بكتيرية ومحسسات ضوئية أخرى مع إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول، مما يتيح تطبيقات واسعة في فحص مضادات العدوى.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: ينمذج عدوى الغشاء الحيوي لبكتيريا S. aureus ذات الصلة سريرياً، مما يربط النتائج المخبرية بالتحقق من الفعالية قبل السريرية للمواد المضادة للعدوى القائمة على PDT.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يوضح آلية عمل PDT عبر صبغ الخلايا الحية/الميتة، مما يقلل من الغموض في مسارات القضاء على الغشاء الحيوي.
- الاستمرارية الانتقالية: يدعم قرارات التطوير من خلال توفير بيانات قابلة للتكرار حول تثبيط الغشاء الحيوي عبر سلالات متعددة ومكررات تجريبية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج هذا المقايسة ضمن سلسلة اكتشاف مضادات البكتيريا، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحسين المركبات الرائدة، وصولاً إلى اختبارات الفعالية قبل السريرية، لا سيما بالنسبة للأنماط العلاجية التي تستهدف الغشاء الحيوي.
- بيولوجيا الاكتشاف: اختبار الفرضيات الميكانيكية لتفكك الغشاء الحيوي وفقدان الحيوية البكتيرية الناجم عن العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) في نموذج ذي صلة فسيولوجياً.
- الفحص: يتيح التقييم الموحد للمواد المحسسة للضوء ومعايير جرعة الضوء من أجل النشاط المضاد للغشاء الحيوي.
- التحليلات: يوفر قياسات لخفض وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) ومقاييس الحيوية القائمة على الفلورة لمقارنة ظروف العلاج وتوجيه علاقات البنية والنشاط.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بين تثبيط الغشاء الحيوي في المختبر ونماذج الفعالية قبل السريرية من خلال نقاط نهاية قابلة للقياس والتكرار.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة نمطية للعلاج الضوئي الديناميكي للأغشية الحيوية قابلة للتطبيق عبر أهداف مسببات أمراض وأنماط كيميائية للمحسسات الضوئية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في تفاعلات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) مع الغشاء الحيوي الرقيق (biofilm) من خلال التصوير المباشر وتقدير كمية القتل البكتيري.
- القيمة التشغيلية: يقدم سير عمل قياسي محمي من الضوء مع خطوات محددة للحضن والتشعيع والقراءة لضمان قابلية التكرار بين المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: يعزز الثقة في اتخاذ قرار المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) لمرشحات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) من خلال توفير بيانات فعالية مبكرة في نموذج غشاء حيوي ذي صلة سريريًا.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد الأولويات لبرامج العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) بناءً على تقييم المخاطر، وذلك عن طريق تحديد المركبات التي تظهر قدرة ملموسة على اختراق الغشاء الحيوي ونشاطاً مضاداً للميكروبات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التقنيات الميكروبيولوجية، وزراعة الغشاء الحيوي (biofilm)، وبروتوكولات السلامة البيولوجية الضوئية.
- يعتمد على معدات التعرض للضوء المتحكم به (على سبيل المثال، مقياس إشعاع LED) ومجهر الفلورسنت أو قارئ الصفائح لقراءات CFU والتصوير.
- يستلزم توحيد تحضير ALA، وتوقيت التحضين، وتوصيل الضوء عبر المجموعات التجريبية لضمان قابلية التكرار.
- قد يتطلب التكيف مع سلالات بكتيرية أخرى تحسين ظروف تكوين الغشاء الحيوي وكفاءة امتصاص المحسس الضوئي.
- قيد عملي: قد تختلف حساسية الغشاء الحيوي وفقاً لمرحلة النمو وتكوين المصفوفة، مما يتطلب ضوابط دقيقة للدراسات المقارنة.
