أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير الوصول إلى عيون الدجاج الجنينية في بيئة مختبرية لتمكين الدراسة المتعمقة لمسارات النمو المعقدة في الجنين. في الدجاج الجنيني ، غالبا ما تكون دراسة العين صعبة ، بسبب نمو الجفن وحركة الجنين ونمو الأنسجة الجنينية الإضافية. يمكن أن يكون للمركبات مثل الأدوية والمثبطات أيضا تأثيرات مميتة على الجنين ، مما يجعل من الصعب استخدام هذه المركبات لتعديل مسارات الجينات.

سمح التقدم في زراعة الأنسجة في المختبر للعلماء بعزل هذه الأنسجة والقضاء على العديد من هذه الحواجز المذكورة أعلاه. بروتوكولنا مفيد لأنه يسمح لنا بدراسة العين ككل ، بما في ذلك جميع الأنسجة التي لديها القدرة على التفاعل أثناء التطور ، مثل الشبكية العصبية والظهارة المصطبغة في الشبكية. ابدأ بتعقيم المواد للتأكد من أن جميع المحاليل والمعدات معقمة قبل الإجراء.

للقيام بذلك ، قم بالأوتوكلاف لترين من الماء المقطر ولتر واحد من محلول ملحي للكتكوت ، جنبا إلى جنب مع علبة من المناديل وورق الترشيح شبه المسامي وشبكة سلكية وحاويات مياه وماصات زجاجية يمكن التخلص منها. قم بتعقيم أرفف الحاضنة والباب جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول ، ثم املأ الحاويات بالماء المقطر المعقم ، وقم بتسخين الحاضنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتسخين وسط المغذيات ، جنبا إلى جنب مع أنبوب من المضاد الحيوي البنسلين ستربتومايسين في الحاضنة.

ضع منشفة ورقية في جميع أنحاء مساحة العمل وقم بتعقيمها بنسبة 70٪ من الإيثانول. تعقيم جميع الملقط والمقص. مع وجود رأس الدجاج في محلول ملحي للكتكوت ، قم بتقسيم رأس الفرخ إلى قسمين في خط الوسط ، مع ترك بعض الأنسجة في لباقة حول كل عين.

ستساعد الأنسجة الزائدة العين في الحفاظ على بعض التوتر في الثقافة ، بالإضافة إلى المساعدة في امتصاص العناصر الغذائية في جميع أنحاء العين ومنع العين من الانزلاق من ورق الترشيح. تعمل هذه الأنسجة أيضا كمعالم عند توجيه العين في التحليل اللاحق. اترك الأنسجة المقطعة في محلول ملحي للكتكوت بدرجة حرارة الغرفة أثناء تحضير المزرعة.

تحضير طبق الثقافة. ضع طبقين من بتري مقاس 35 ملم داخل طبق بتري واحد مقاس 100 ملم. ضع مرحلة واحدة من الشبكات السلكية في كل طبق صغير.

ضع نصف الرأس بالعين على قطعة من ورق الترشيح ، مع إمالة قليلا لضمان عدم انزلاق العين عن الورق. انقل المناديل الورقية وورق الترشيح إلى طبق بتري الصغير فوق مرحلة الشبكة السلكية. كرر مع نصف الرأس الآخر من نفس الجنين.

أضف وسيطا ثقافيا إلى كل من طبقي بتري الصغيرين. ارفع الوسيط إلى مستوى المناديل الورقية. لا تغمر الأنسجة في الوسط.

أضف 50 ميكرولترا من محلول مخزون المضاد الحيوي البنسلين ستربتومايسين إلى وسط المغذيات في كل طبق من أجل منع العدوى البكتيرية. ضع قطعة مطوية من الأنسجة الرقيقة على الحافة الداخلية لطبق بتري الأكبر وقم بترطيبها بالماء المقطر. احتضان المزرعة في الحاضنة المظلمة عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أيام.

بعد الزراعة ، قم بإزالة الأنسجة من ورق الترشيح وثبتها في 4٪ بارافورمالدهايد. يظهر العمود الأول عين HH34 ، تمثل عين الفرخ الجنينية في بداية الزراعة. يظهر العمود الثاني عين كتكوت جنينية مستزرعة لمدة أربعة أيام ، بدءا من HH34.

يظهر العمود الثالث عين HH38 ، والتي تتوافق مع أربعة أيام من التطور داخل البيضا بعد HH34. الألواح من A إلى F غير ملطخة ، بينما الألواح من G إلى I ملطخة بإنزيم الفوسفاتيز القلوي. يظهر الصف العلوي ، الألواح من A إلى C ، أن العين تستمر في التطور في جميع أنحاء الثقافة ، كما يتضح من ظهور براعم الريش ونمو الجفون ، المشار إليها بالسهام في كل لوحة.

الصف الأوسط ، الألواح من D إلى F ، أن الحليمات الملتحمة تبدأ في التدهور في الثقافة. يوضح الصف السفلي ، اللوحات من G إلى I ، أن النمط الزماني المكاني لتحريض العظام الصلبة يتم الحفاظ عليه في الثقافة ، وهو بمثابة مثال على مسار تنموي يمكن دراسته باستخدام هذه الطريقة. يسمح هذا البروتوكول للأنسجة بالحفاظ على الجوانب المكانية والزمانية الرئيسية للتطور في جميع أنحاء الثقافة.

يمثل هذا البروتوكول تقدما رئيسيا في زراعة الأعضاء الحسية بأكملها ، مما يوفر منهجية بديلة لدراسة مسارات النمو المعقدة المعنية.