خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث علم الأعصاب ، مثل توصيف السكان العصبيين أو تحديد مصادر وأهداف أنظمة النقل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد ملف تعريف التعبير لمجموعة مختارة مسبقا من الجينات من خلية واحدة بسرعة وسهولة. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لماوس التنوع العشوائي.

يمكن أيضا تطبيقه على أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية وفي العديد من النماذج الحيوانية. يعد هذا العرض التوضيحي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم خطوات الاعتقال والطموح لأن البيانات تحتاج إلى كمية من السيتوبلازم لتحليلها. قبل التقسيم ، قم بإعداد مجموعة تشريح تحتوي على مقص جراحي ، ومقص قزحية دقيقة ، وملعقين ، وملقط ، وقرص من مرشح الورق ، وغراء سيانواكريلات.

ثم قم بتشبع محلول القطع المثلج البارد بالكربوجين وتبريد غرفة القطع عند سالب 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة فروة رأس وافتح الجمجمة. استخرج الدماغ بعناية وضعه في دورق صغير مملوء بمحلول التقطيع البارد المكربوجن.

بعد ذلك ، قم بإزالة حجرة القطع من سالب 20 درجة مئوية وإزالة الرطوبة بمنشفة ورقية. قم بتشريح الدماغ بعناية لعزل منطقة الاهتمام. قم بلصقها في حجرة التقطيع وأضف محلول القطع البارد المكربوجيني.

باستخدام الاهتزاز ، قسم شرائح بسمك 300 ميكرومتر. انقل الشرائح إلى غرفة راحة مملوءة بمحلول القطع المؤكسج في درجة حرارة الغرفة واتركها تتعافى لمدة 30 دقيقة على الأقل. بالنسبة لخلية واحدة RT-PCR وتوصيف الخلية المستهدفة ، حدد تسجيل الخلية بأكملها بما لا يزيد عن 20 دقيقة من أجل الحفاظ على mRNAse.

في نهاية التسجيل ، قم بإعداد أنبوب PCR سعة 500 ميكرولتر مملوء بميكرولترين من مزيج 5xRT و 0.5 ميكرولتر من 20xDTT. قم بتدويرها وتخزينها على الثلج. ثم احصد سيتوبلازم الخلية عن طريق الضغط السلبي اللطيف.

راقب محتوى الخلية وتحكم فيه من الدخول إلى الماصة مع الحفاظ على إحكام الإغلاق وتجنب جمع النواة إذا تم أخذ بعض الجينات في الاعتبار. في حالة الجين ، من الضروري تجنب جمع النواة وتضمين مجموعة من الاشعال التي تهدف إلى تضخيم gDNA للتحضير للتلوث العام. إذا اقتربت النواة من طرف الماصة، فحرر الضغط السلبي وحرك الماصة بعيدا.

تأكد من الحفاظ على مانع التسرب المحكم وأعد تشغيل تجميع السيتوبلازم في موقع الماصة الجديد. بعد ذلك ، اسحب الماصة برفق لتشكيل رقعة خارجية للحد من التلوث بالحطام خارج الخلية ولتفضيل إغلاق غشاء الخلية للتحليل الكيميائي النسيجي اللاحق. ضع في اعتبارك أن النتوءات أو المتلاعبات الدقيقة أو لوحة مفاتيح الكمبيوتر أو ماوس الكمبيوتر هي مصادر مشحونة بالبروتون لتلوث الرناز.

إذا تم لمسها أثناء التسجيل ، فقم بتغيير القفازات. بعد ذلك ، قم بتوصيل الماصة بالطارد ، وطرد محتواها في أنبوب PCR عن طريق الضغط الإيجابي. اكسر طرف الماصة في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل للمساعدة في جمع محتوياتها.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة ، أضف 0.5 ميكرولتر من مثبط RNAse و 0.5 ميكرولتر من RTAse. تخلط برفق ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتدوير الأنبوب ، وتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.

حتى تحليل PCR وإجراء خطوة التضخيم الأولى. للتحقق من صحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، امزج زوج أولي وتخفيفه، أضف ميكرومولار واحدا باستخدام الماصة المخصصة ل RTPCR أحادية الخلية. اضبط الدراجة الحرارية لمدة ثلاث دقائق على 95 درجة مئوية ، وقم بتشغيل 40 دورة تليها خطوة استطالة أخيرة عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

لتقليل تكوين ثنائيات التمهيدي ، قم بإجراء بداية ساخنة عن طريق وضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري المسخن مسبقا عند 95 درجة مئوية. بعد 30 ثانية ، طرد بسرعة 20 ميكرولترا من مزيج التمهيدي فوق الزيت. بمجرد التحقق من صحة زوج التمهيدي ، اختبره باستخدام بروتوكول تعدد الإرسال.

امزج وخفف البرايمر الخارجي معا في ميكرومولار واحد. قم بتخزين مزيج البرايمر متعدد الإرسال على حرارة سالب 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أسابيع. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج مسبق وضعه على الثلج.

فوق أنبوب PCR وقم بتدويره وأضف قطرتين من الزيت المعدني. بعد ثلاث دقائق عند 95 درجة مئوية ، قم بتشغيل 20 دورة PCR. قم بإجراء بداية ساخنة كما هو موضح باستخدام 20 ميكرولترا من مزيج التمهيدي المتعدد.

بعد ذلك ، قم بإعداد عدد من أنابيب PCR مطابقة لعدد الجينات التي يتم تحليلها. قم بإعداد مزيج مسبق باستخدام ميكرولتر واحد من أول منتج PCR لكل جين كقالب. اضبط جميع الأحجام وفقا لعدد الجينات المراد تحليلها وفكر في استخدام 10٪ من الحجم الإضافي للتعويض عن أخطاء سحب العينات.

رج العبوة برفق ، وقم بتدوير الأنبوب وأرسل 80 ميكرولترا من الخلطة المسبقة في كل أنبوب PCR. أضف قطرتين من الزيت المعدني لكل أنبوب دون لمس الجدار أو غطاء الأنابيب. قم بتشغيل 35 دورة PCR ثم قم بإجراء بداية ساخنة عن طريق طرد 20 ميكرولترا من مزيج التمهيدي الداخلي.

تحليل مشاريع تفاعل البوليميراز المتسلسل الثانية عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأراغوز. تم التعرف على الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الخامسة بصريا من خلال سوما الكبيرة والتغصنات القمية البارزة. كشف تسجيل خلية السحب عن خصائص فيزيولوجية كهربية نموذجية للطبقة الخامسة من الخلايا العصبية المنتظمة المتصاعدة مع مقاومة منخفضة للإدخال ، وإمكانات عمل طويلة الأمد ، وتكيف واضح مع تردد السنبل.

كشف التحليل الجزيئي لهذه الخلايا العصبية عن التعبير عن vGluT1 ، مما يؤكد نمطها الظاهري الجلوتاميتريكي. عبرت هذه الخلايا العصبية أيضا عن السوماتوستاتين و ATP1-alpha-1 وثلاث وحدات فرعية من الصوديوم والبوتاسيوم ATPAs. أكد وضع العلامات على Biocytin للخلايا العصبية المسجلة مورفولوجيا هرمية.

كما هو متوقع من الخلايا العصبية الجلوتاميتيرجيكية ، كشف التحليل الجزيئي ل 26 خلية هرمية من الطبقة الخامسة ، عن التعبير عن vGluT1 ولكن أيا من GADs. بمجرد أن يتم القيام بالتقنية في غضون يومين ، إذا تم تشكيلها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر الشديد لتجنب التلوث.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق في التعبير عن 10 جينات في وقت واحد من الخلايا المفردة التي تتميز بتكتلات التصحيح وفقا لشرائح الدماغ ، بعد حصاد السيتوبلازم ، والنسخ العكسي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الساخن. لا تنس أن العمل مع بروميد الإيثيديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.